Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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लेखक ऊतक नमूना तैयारी के साथ विशेषज्ञ सहायता के लिए स्टोनी ब्रुक कैंसर सेंटर हिस्टोलॉजी रिसर्च कोर और पशु देखभाल और हैंडलिंग के साथ सहायता के लिए स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन प्रभाग को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान डीके 124342 से एग्निएस्का बी बियालकोवस्का और डीके052230 से डॉ विन्सेंट डब्ल्यू यांग को दिए गए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी चूहों को स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन प्रभाग (डीएलएआर) में रखा गया था। स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) ने पशु विषयों से जुड़े सभ?...

यह प्रोटोकॉल एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकिरण चोट मॉडल का वर्णन करता है। यह चोट के बाद 7 दिनों के दौरान आंतों के उपकला में परिवर्तन के सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से,...

मानव आंतों के उपकला आधे बैडमिंटन कोर्ट की सतह को कवर करेंगे यदि पूरी तरह से सपाट1 रखा जाए। इसके बजाय, मनुष्यों को उनके गले की सामग्री से अलग करने वाली इस एकल कोशिका परत को उंगली जैसे अनुमानों, विली और इंडेंटेशन, क्रिप्ट्स की एक श्रृंखला में कॉम्पैक्ट किया जाता है जो आंतों के सतह क्षेत्र को अधिकतम करते हैं। एपिथेलियम की कोशिकाएं एक क्रिप्ट-विलस अक्ष के साथ अंतर करती हैं। विलस में मुख्य रूप से पोषक तत्वों को अवशोषित करने वाले एंटरोसाइट्स, बलगम-स्रावित गोब्लेट कोशिकाएं और हार्मोन-उत्पादक एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं होती हैं, जबकि क्रिप्ट्स में मुख्य रूप से डेफेंसिन-उत्पादक पनेथ कोशिकाएं, सक्रिय और आरक्षित स्टेम कोशिकाएं और पूर्वज कोशिकाएं 2,3,4,5 होती हैं। इसके अलावा, अंतर्निहित मेसेनकाइमल डिब्बे के स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ इन कोशिकाओं का द्वि-दिशात्मक संचार होता है और लुमेन का माइक्रोबायोटा बातचीत का एक जटिल नेटवर्क उत्पन्न करता है जो आंत होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है और चोट 6,7,8 के बाद वसूली के लिए महत्वपूर्ण है।
आंतों का एपिथेलियम मानव शरीर में सबसे तेजी से स्व-नवीनीकृत ऊतक है, जिसमें 2-6 दिनों की कारोबार दर 9,10,11 है। होमियोस्टैसिस के दौरान, आंतों के क्रिप्ट्स (क्रिप्ट बेस कॉलमर कोशिकाओं) के आधार पर सक्रिय स्टेम कोशिकाएं, ल्यूसीन युक्त रिपीट-युक्त जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 5 (एलजीआर 5) की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित होती हैं, तेजी से विभाजित होती हैं और पूर्वज कोशिकाओं को प्रदान करती हैं जो अन्य सभी आंतों के उपकला वंशों में अंतर करती हैं। हालांकि, उनकी उच्च माइटोटिक दर के कारण, सक्रिय स्टेम कोशिकाएं और उनके तत्काल पूर्वज गामा-विकिरण की चोट के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील होते हैं और विकिरण 5,12,13,14 के बाद एपोप्टोसिस से गुजरते हैं। उनके नुकसान पर, आंतों के क्रिप्ट के भीतर आरक्षित स्टेम सेल और गैर-स्टेम सेल (पूर्वजों और कुछ टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं की उप-जनसंख्या) सक्रियण से गुजरते हैं और बेसल क्रिप्ट कम्पार्टमेंट को फिर से भरते हैं, जो तब विली की सेल आबादी का पुनर्गठन कर सकते हैं और इस प्रकार, आंतों के उपकला15 को पुनर्जीवित कर सकते हैं। वंश अनुरेखण तकनीकों का उपयोग करते हुए, कई शोध समूहों ने प्रदर्शित किया है कि आरक्षित (क्विसेंट) स्टेम कोशिकाएं सक्रिय स्टेम कोशिकाओं 13,16,17,18,19,20,21,22 के नुकसान पर पुनर्जनन का समर्थन करने में सक्षम हैं। इन कोशिकाओं को पॉलीकॉम्ब कॉम्प्लेक्स प्रोटीन 1 ऑन्कोजीन (बीएमआई 1), माउस टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस जीन (एमटीआरटी), हॉप होमोबॉक्स (हॉपक्स), और ल्यूसीन युक्त रिपीट प्रोटीन 1 जीन (एलआरआईजी 1) की उपस्थिति की विशेषता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि गैर-स्टेम कोशिकाएं चोट 23,24,25,26,27,28,29,30,31 पर आंतों के क्रिप्ट को फिर से भरने में सक्षम हैं। विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि स्रावी कोशिकाओं और एंटरोसाइट्स के पूर्वज चोट लगने पर डिडिफरेंटेशन से गुजरते हैं, स्टेम जैसी कोशिकाओं में वापस आ जाते हैं, और आंतों के उपकला के उत्थान का समर्थन करते हैं। हाल के अध्ययनों ने कई मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की पहचान की है जो चोट पर स्टेम जैसी विशेषताओं को प्राप्त करने की क्षमता रखते हैं (जैसे डीएलएल +, एटीओएच 1 +, प्रोएक्स 1 +, एमआईएसटी 1 +, डीसीएलके 1 +) 3 2,33,34,35,36। आश्चर्यजनक रूप से, यू एट अल ने दिखाया कि यहां तक कि परिपक्व पनेथ कोशिकाएं (एलवाईजेड +) आंतों के पुनर्जनन में योगदान कर सकतीहैं। इसके अलावा, आंतों के उपकला कोशिकाओं के एपोप्टोसिस और उपकला बाधा समारोह को बाधित करने के अलावा, विकिरण के परिणामस्वरूप आंत वनस्पतियों का डिस्बिओसिस, प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण और एक प्रो-भड़काऊ प्रतिक्रिया की शुरुआत, और मेसेनकाइमल और स्ट्रोमल कोशिकाओं की सक्रियता38,39 होती है।
गामा विकिरण कैंसर के उपचार में एक मूल्यवान चिकित्सीय उपकरण है, खासकर कोलोरेक्टल ट्यूमर40 के लिए। हालांकि, विकिरण कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाकर आंतों के होमियोस्टैसिस को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है, जिससे एपोप्टोसिस होता है। विकिरण जोखिम कई गड़बड़ियों का कारण बनता है जो रोगी की वसूली को धीमा कर देता है और तीव्र चरण में म्यूकोसल चोट और सूजन और दस्त, असंयम, रक्तस्राव और पेट दर्द द्वारा चिह्नित होता है। अभिव्यक्तियों के इस पैनोपली को गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकिरण विषाक्तता के रूप में जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, ट्रांसम्यूरल फाइब्रोसिस और / या संवहनी स्क्लेरोसिस की विकिरण-प्रेरित प्रगति केवल उपचार38,41 के बाद ही प्रकट हो सकती है। चोट के साथ-साथ, विकिरण आंतों की कोशिकाओं में एक मरम्मत प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है जो पुनर्जनन शुरू करने और व्यवस्थित करने के लिए जिम्मेदार सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करताहै। विकिरण-प्रेरित छोटे आंत्र रोग अन्य अंगों (जैसे गर्भाशय ग्रीवा, प्रोस्टेट, अग्न्याशय, मलाशय) को प्रदान की गई पैल्विक या पेट रेडियोथेरेपी से उत्पन्न हो सकते हैं 41,43,44,45,46। आंतों के विकिरण की चोट, इस प्रकार, एक महत्वपूर्ण नैदानिक मुद्दा है, और परिणामस्वरूप पैथोफिज़ियोलॉजी की बेहतर समझ रेडियोथेरेपी से जुड़ी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल जटिलताओं को कम करने के लिए हस्तक्षेप के विकास को आगे बढ़ाने की संभावना है। अन्य तकनीकें हैं जो विकिरण के अलावा आंतों के उपकला के पुनर्योजी उद्देश्य की जांच करने की अनुमति देती हैं। सूजन और उसके बाद पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक और रासायनिक मुराइन मॉडल विकसितकिए गए हैं। डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) आंत में सूजन को प्रेरित करता है और सूजन आंत्र रोग के समान विशेषताओं के विकास की ओर जाताहै। प्रो-कार्सिनोजेनिक यौगिक एज़ोक्सीमेथेन (एओएम) के साथ डीएसएस उपचार के संयोजन के परिणामस्वरूप कोलाइटिस से जुड़े कैंसर48,49 का विकास हो सकता है। इस्केमिया रीपरफ्यूजन-प्रेरित चोट आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए नियोजित एक और विधि है। इस तकनीक के लिए अनुभव और शल्य चिकित्सा ज्ञान की आवश्यकता होतीहै। इसके अलावा, उपरोक्त तकनीकें विकिरण की तुलना में विभिन्न प्रकार की चोट का कारण बनती हैं और पुनर्जनन के विभिन्न तंत्रों की भागीदारी का कारण बन सकती हैं। इसके अलावा, ये मॉडल समय लेने वाले हैं, जबकि विकिरण तकनीक काफी संक्षिप्त है। हाल ही में, आंत और बृहदान्त्र से उत्पन्न एंटरोइड्स और कोलोनोइड्स का उपयोग करने वाले इन विट्रो तरीकों का उपयोग आंतों के पुनर्जनन51,52 के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकिरण की चोट के साथ संयोजन में किया गया है। हालांकि, ये तकनीकें53,54 मॉडल के अंग को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करती हैं।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एक आनुवंशिक मॉडल के साथ संयोजन में गामा-विकिरण चोट के एक मुराइन मॉडल का विवरण शामिल है, जो टैमोक्सीफेन उपचार के बाद, आरक्षित स्टेम सेल आबादी (बीएमआई 1-सीआरई ईआर) से उत्पन्न वंशावली का पता लगाने की अनुमति देताहै। Rosa26eYFP)। यह मॉडल 12 Gy कुल-शरीर विकिरण का उपयोग करता है, जो आरक्षित स्टेम कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण आंतों की चोट को प्रेरित करता है, जबकि अभी भी चोट के 7 दिनों के भीतर आंतों की पुनर्योजी क्षमता की बाद की जांच की अनुमतिदेता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

आंतों के उपकला में कोशिकाओं की एक एकल परत होती है, फिर भी इसमें कई प्रकार की टर्मिनल विभेदित कोशिकाएं होती हैं, जो आंतों के क्रिप्ट के तल पर स्थित आंतों की स्टेम कोशिकाओं के सक्रिय प्रसार से उत्पन्न होती हैं। हालांकि, तीव्र आंतों की चोट की घटनाओं के दौरान, ये सक्रिय आंतों की स्टेम कोशिकाएं कोशिका मृत्यु से गुजरती हैं। गामा विकिरण एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला कोलोरेक्टल कैंसर उपचार है, जो चिकित्सीय रूप से प्रभावोत्पादक होने के बावजूद, सक्रिय स्टेम सेल पूल को कम करने का दुष्प्रभाव है। दरअसल, सक्रिय स्टेम सेल की कमी के कारण रेडियोथेरेपी से गुजरते समय रोगियों को अक्सर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकिरण सिंड्रोम का अनुभव होता है। आंतों के क्रिप्ट्स में सक्रिय आंतों की स्टेम कोशिकाओं का नुकसान आमतौर पर क्विसेंट रिजर्व आंतों की स्टेम कोशिकाओं के एक पूल को सक्रिय करता है और स्रावी और एंटरोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं के विघटन को प्रेरित करता है। यदि इन कोशिकाओं के लिए नहीं, तो आंतों के उपकला में रेडियोथेरेपी और ऐसे अन्य प्रमुख ऊतक अपमान से उबरने की क्षमता की कमी होगी। वंश-अनुरेखण प्रौद्योगिकियों में नई प्रगति पुनर्जनन के दौरान कोशिकाओं के सक्रियण, भेदभाव और प्रवास की ट्रैकिंग की अनुमति देती है और आंत में इसका अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित की गई है। इस अध्ययन का उद्देश्य विकिरण की चोट के बाद माउस आंतों के उपकला के भीतर कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक विधि को चित्रित करना है।

मुराइन आनुवंशिक वंश अनुरेखण के साथ संयोजन में 12 जी कुल-शरीर विकिरण (टीबीआई) का उपयोग आंत में विकिरण की चोट के परिणामों के गहन विश्लेषण की अनुमति देता है। शुरू करने के लिए, बीएमआई1-सीआरई ईआर; रोसा 26ई...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट रेडियोथेरेप्यूटिक कैंसर उपचार पर चोट के लिए सबसे संवेदनशील अंगों में से एक है। यह एक साथ एक अंग प्रणाली है जिसमें इस तरह के अपमान के बाद उच्चतम पुनर्योजी क्षमताओं में से एक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है।

आयनीकरण विकिरण के जवाब में आंतों के उपकला पुनर्जनन

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

गामा विकिरण कोलोरेक्टल कैंसर के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला उपचार है। और जब यह चिकित्सीय रूप से प्रभावोत्पादक है, तो इसका जठरांत्र संबंधी मार्ग पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल विकिरण की चोट के बाद पुनर्जनन के दौरान कोशिकाओं के सक्रियण, भेदभाव और प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है।यह प्रोटोकॉल एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकिरण चोट मॉडल का वर्णन करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह मॉडल चोट के बाद आंतों के सेल भाग्य को ट्रैक करने की अनुमति देता है और इस प्रकार विशिष्ट सेल उप-जनसंख्या की पुनर्योजी क्षमता की बेहतर समझ प्रदान करता है। यह तकनीक वास्तविक समय के व्यवहार और चोट के बाद कोशिकाओं की विभिन्न उप-आबादी की बातचीत का अध्ययन करने के लिए अलग-अलग वंश-अनुरेखण पशु मॉडल को नियोजित कर सकती है।इस प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों को विकिरण की चोट पर माइक्रोबायोटा और विभिन्न उपकला, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के बीच संबंधों की जांच की अनुमति देनी चाहिए। शुरू करने के लिए, बाँझ मकई के तेल में 30 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की एकाग्रता पर टैमोक्सीफेन पाउडर को फिर से निलंबित करें। 60% आयाम के साथ 30 सेकंड के ऑन-ऑफ चक्रों में तीन मिनट के लिए सोनिकेट करें।कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए अंधेरे में रोटेशन द्वारा मिलाएं। फिर, ईडीयू पाउडर में बाँझ डीएमएसओ जोड़कर ईडीयू तैयार करें। कुल आयतन का 1/5 जोड़ें, और धीरे-धीरे बाँझ अल्ट्राप्योर पानी की शेष मात्रा जोड़ें।जब पूरी तरह से घुल जाता है, तो एलिकोट करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ऊतक संग्रह और निर्धारण के लिए अभिकर्मक तैयार करें, जैसे कि पानी में 70% इथेनॉल, डीपीबीएस चार डिग्री सेल्सियस तक ठंडा, बौइन का फिक्सेटिव बफर और 10% बफर्ड फॉर्मेलिन। इसके बाद, आवश्यक उपकरण तैयार करें, जैसे कि चूहों की विच्छेदन किट, पेट्री व्यंजन, 10 मिलीलीटर सिरिंज और हिस्टोलॉजिकल कैसेट से जुड़ी 16-गेज गैवेज सुई।गामा विकिरण जोखिम से दो दिन पहले, टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के लिए प्रयोगात्मक जानवरों को तैयार करें। प्रत्येक जानवर का वजन करें, और आवश्यक खुराक की गणना करें। 70% इथेनॉल के साथ पेट के क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।फिर, क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन को प्रेरित करने के लिए एक-मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 27-गेज सुई का उपयोग करके टैमोक्सीफेन इंट्रापेरिटोनियल की एक खुराक का प्रशासन करें। संभावित टैमोक्सीफेन विषाक्तता को बाहर करने के लिए अगले 48 घंटों के लिए जानवरों का निरीक्षण करें। 48 घंटों के बाद, जानवरों को विकिरण कक्ष में स्थानांतरित करें।70% इथेनॉल समाधान के साथ गामा इरेडिएटर में नमूना कक्ष को कीटाणुरहित करें। नमूना कक्ष के अंदर शोषक मैट और जानवरों को रखें। ढक्कन रखें, और कक्ष बंद करें।गामा इरेडिएटर को जानवरों को 12 ग्रे कुल शरीर विकिरण के लिए उजागर करने के लिए प्रोग्राम करें। फिर, कुंजी को प्रारंभ स्थिति में घुमाएं, और एक्सपोज़र शुरू करने के लिए प्रारंभ दबाएं। सक्रिय एक्सपोजर समय के लिए कमरे को छोड़ दें।पूर्व निर्धारित समय बीत जाने के बाद, मशीन स्वचालित रूप से बंद हो जाएगी और बीपिंग शुरू कर देगी। कुंजी को स्टॉप स्थिति में बदलकर मशीन को बंद करें। नमूना कक्ष खोलें, और ढक्कन उतारें।जानवरों को पिंजरे में स्थानांतरित करें, और 70% इथेनॉल के साथ नमूना कक्ष को कीटाणुरहित करें। जानवरों को पारंपरिक आवास कक्ष में वापस स्थानांतरित करें, और उपचार के बाद उनकी स्थिति का निरीक्षण करें। हर दिन जानवरों के वजन की निगरानी करें।नियोजित इच्छामृत्यु से तीन घंटे पहले, पेट के क्षेत्र को कीटाणुरहित करें, और चूहों को 28-गेज इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके ईडीयू स्टॉक समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। जानवर को यूथेनाइज़ करने के बाद, विकिरण के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर समीपस्थ आंतों को इकट्ठा करें। छोटी आंत के समीपस्थ भाग को विच्छेदित करें, और संलग्न ऊतकों को हटा दें।10-मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 16-गेज सीधी फीडिंग सुई का उपयोग करके ठंडे डीपीबीएस के साथ ऊतक को फ्लश करें, और बौइन के फिक्सेटिव बफर के साथ ऊतक को ठीक करें। आंतों को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें, और स्विस-रोल तकनीक का उपयोग करके समीपस्थ आंतों को रोल करें। ऊतकों को 10% बफर फॉर्मेलिन के साथ एक कंटेनर में हिस्टोलॉजिकल कैसेट में रखें, और इसे कमरे के तापमान पर 24 से 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, हिस्टोलॉजिकल कैसेट को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें, और ऊतक को पैराफिन में एम्बेड करें। एम्बेड करने के बाद, हिस्टोलॉजिकल कैसेट को कम से कम एक घंटे के लिए बर्फ पर रखें। फिर, एक माइक्रोटोम का उपयोग करके पांच-माइक्रोन-मोटी क्षैतिज खंडों को काटें।ऊतक वर्गों को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में स्थानांतरित करें, और अनुभागों को चार्ज स्लाइड पर रखें। स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर रात भर रैक पर सूखने के लिए छोड़ दें। छोटी आंत के नमूनों की हेमटोक्सिलिन और ईओसिन छवियों ने शून्य घंटे में एक होमियोस्टैटिक आंतों के उपकला को दिखाया, इसके बाद एपोप्टोटिक चरण के दौरान क्रिप्ट डिब्बों के भीतर कोशिकाओं का नुकसान हुआ।इसके बाद पुनर्योजी चरण आया जिसमें अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं ने क्रिप्ट्स को आबाद किया, जिससे सातवें दिन तक सामान्यीकरण चरण हुआ। ईवाईएफपी द्वारा वंश अनुरेखण से पता चला है कि होमियोस्टैसिस के दौरान, बीएमआई 1 पॉजिटिव रिजर्व स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न कोशिकाएं क्रिप्ट्स के भीतर प्लस चार से प्लस छह पदों तक सीमित थीं। ईडीयू और केआई -67 धुंधला होने से शाम विकिरणित चूहों में सामान्य आंतों के होमियोस्टैसिस दिखाई दिए, जो सक्रिय स्टेम कोशिकाओं से पारगमन-प्रवर्धन क्षेत्र के माध्यम से फैले हुए थे।एपोप्टोटिक चरण के दौरान, ईवाईएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में कमी आई, विकिरण क्षति के कारण प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के नुकसान के साथ। पुनर्योजी चरण में, आरक्षित स्टेम कोशिकाओं की सक्रियता और बीएमआई 1-पॉजिटिव कोशिकाओं का तेजी से प्रसार देखा गया। आगे प्रसार और प्रवासन ने आंतों के उपकला अखंडता को बहाल किया।ट्यूनल धुंधला होने से पता चला कि होमोस्टेसिस के दौरान एपोप्टोटिक कोशिकाएं अनुपस्थित हैं। एपोप्टोटिक चरण में देर से ट्यूनल धुंधलापन में वृद्धि देखी गई थी। पुनर्योजी चरण के दौरान, ट्यूनल धुंधलापन पुनर्जनन क्रिप्ट्स के भीतर लगातार कम हो गया और क्रिप्ट्स के सामान्य होने पर लगभग अनुपस्थित था।इस तकनीक को आरएनए अनुक्रमण, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग, या प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि चोट के बाद आंतों के पुनर्जनन के दौरान विशिष्ट सेल वंश की भूमिका के बारे में अधिक गहन ज्ञान प्राप्त किया जा सके। शोधकर्ता आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता की समझ का विस्तार करने के लिए आंत पुनर्जनन में माइक्रोबायोटा और उपकला, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के बीच बातचीत की जांच कर सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Cortical Neurogenesis: प्रयोगशाला में अग्रिम से सेल आधारित चिकित्सा में संक्रमण

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

ΓH2AX foci के Ionising विकिरण करने के लिए प्रत्युत्तर में मात्रा का ठहराव

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

विकिरण के बाद γH2AX के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

न्यूट में लेंस पुनर्जनन अध्ययन संवर्धन परितारिका वर्णक उपकला कोशिकाओं के लिए एक प्रणाली

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Zebrafish Pronephros के लेजर एबलेशन गुर्दे उपकला पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

शाही सेना शोधन द्वारा chromatin अलगाव (कूजन)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

बाल उत्थान के दौरान तेजी से उपकला-mesenchymal संकेतन की आनुवांशिक विश्लेषण

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

हाइड्रा में glutathione प्रेरित दूध पिलाने की प्रतिक्रिया को मापने

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...