Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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लेखक ऊतक नमूना तैयारी के साथ विशेषज्ञ सहायता के लिए स्टोनी ब्रुक कैंसर सेंटर हिस्टोलॉजी रिसर्च कोर और पशु देखभाल और हैंडलिंग के साथ सहायता के लिए स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन प्रभाग को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान डीके 124342 से एग्निएस्का बी बियालकोवस्का और डीके052230 से डॉ विन्सेंट डब्ल्यू यांग को दिए गए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

सभी चूहों को स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु संसाधन प्रभाग (डीएलएआर) में रखा गया था। स्टोनी ब्रुक विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) ने पशु विषयों से जुड़े सभ?...

यह प्रोटोकॉल एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकिरण चोट मॉडल का वर्णन करता है। यह चोट के बाद 7 दिनों के दौरान आंतों के उपकला में परिवर्तन के सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से,...

मानव आंतों के उपकला आधे बैडमिंटन कोर्ट की सतह को कवर करेंगे यदि पूरी तरह से सपाट1 रखा जाए। इसके बजाय, मनुष्यों को उनके गले की सामग्री से अलग करने वाली इस एकल कोशिका परत को उंगली जैसे अनुमानों, विली और इंडेंटेशन, क्रिप्ट्स की एक श्रृंखला में कॉम्पैक्ट किया जाता है जो आंतों के सतह क्षेत्र को अधिकतम करते हैं। एपिथेलियम की कोशिकाएं एक क्रिप्ट-विलस अक्ष के साथ अंतर करती हैं। विलस में मुख्य रूप से पोषक तत्वों को अवशोषित करने वाले एंटरोसाइट्स, बलगम-स्रावित गोब्लेट कोशिकाएं और हार्मोन-उत्पादक एंटरोएंडोक्राइन कोशिकाएं होती हैं, जबकि क्रिप्ट्स में मुख्य रूप से डेफेंसिन-उत्पादक पनेथ कोशिकाएं, सक्रिय और आरक्षित स्टेम कोशिकाएं और पूर्वज कोशिकाएं 2,3,4,5 होती हैं। इसके अलावा, अंतर्निहित मेसेनकाइमल डिब्बे के स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ इन कोशिकाओं का द्वि-दिशात्मक संचार होता है और लुमेन का माइक्रोबायोटा बातचीत का एक जटिल नेटवर्क उत्पन्न करता है जो आंत होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है और चोट 6,7,8 के बाद वसूली के लिए महत्वपूर्ण है।
आंतों का एपिथेलियम मानव शरीर में सबसे तेजी से स्व-नवीनीकृत ऊतक है, जिसमें 2-6 दिनों की कारोबार दर 9,10,11 है। होमियोस्टैसिस के दौरान, आंतों के क्रिप्ट्स (क्रिप्ट बेस कॉलमर कोशिकाओं) के आधार पर सक्रिय स्टेम कोशिकाएं, ल्यूसीन युक्त रिपीट-युक्त जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 5 (एलजीआर 5) की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित होती हैं, तेजी से विभाजित होती हैं और पूर्वज कोशिकाओं को प्रदान करती हैं जो अन्य सभी आंतों के उपकला वंशों में अंतर करती हैं। हालांकि, उनकी उच्च माइटोटिक दर के कारण, सक्रिय स्टेम कोशिकाएं और उनके तत्काल पूर्वज गामा-विकिरण की चोट के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील होते हैं और विकिरण 5,12,13,14 के बाद एपोप्टोसिस से गुजरते हैं। उनके नुकसान पर, आंतों के क्रिप्ट के भीतर आरक्षित स्टेम सेल और गैर-स्टेम सेल (पूर्वजों और कुछ टर्मिनल रूप से विभेदित कोशिकाओं की उप-जनसंख्या) सक्रियण से गुजरते हैं और बेसल क्रिप्ट कम्पार्टमेंट को फिर से भरते हैं, जो तब विली की सेल आबादी का पुनर्गठन कर सकते हैं और इस प्रकार, आंतों के उपकला15 को पुनर्जीवित कर सकते हैं। वंश अनुरेखण तकनीकों का उपयोग करते हुए, कई शोध समूहों ने प्रदर्शित किया है कि आरक्षित (क्विसेंट) स्टेम कोशिकाएं सक्रिय स्टेम कोशिकाओं 13,16,17,18,19,20,21,22 के नुकसान पर पुनर्जनन का समर्थन करने में सक्षम हैं। इन कोशिकाओं को पॉलीकॉम्ब कॉम्प्लेक्स प्रोटीन 1 ऑन्कोजीन (बीएमआई 1), माउस टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस जीन (एमटीआरटी), हॉप होमोबॉक्स (हॉपक्स), और ल्यूसीन युक्त रिपीट प्रोटीन 1 जीन (एलआरआईजी 1) की उपस्थिति की विशेषता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि गैर-स्टेम कोशिकाएं चोट 23,24,25,26,27,28,29,30,31 पर आंतों के क्रिप्ट को फिर से भरने में सक्षम हैं। विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि स्रावी कोशिकाओं और एंटरोसाइट्स के पूर्वज चोट लगने पर डिडिफरेंटेशन से गुजरते हैं, स्टेम जैसी कोशिकाओं में वापस आ जाते हैं, और आंतों के उपकला के उत्थान का समर्थन करते हैं। हाल के अध्ययनों ने कई मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की पहचान की है जो चोट पर स्टेम जैसी विशेषताओं को प्राप्त करने की क्षमता रखते हैं (जैसे डीएलएल +, एटीओएच 1 +, प्रोएक्स 1 +, एमआईएसटी 1 +, डीसीएलके 1 +) 3 2,33,34,35,36। आश्चर्यजनक रूप से, यू एट अल ने दिखाया कि यहां तक कि परिपक्व पनेथ कोशिकाएं (एलवाईजेड +) आंतों के पुनर्जनन में योगदान कर सकतीहैं। इसके अलावा, आंतों के उपकला कोशिकाओं के एपोप्टोसिस और उपकला बाधा समारोह को बाधित करने के अलावा, विकिरण के परिणामस्वरूप आंत वनस्पतियों का डिस्बिओसिस, प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण और एक प्रो-भड़काऊ प्रतिक्रिया की शुरुआत, और मेसेनकाइमल और स्ट्रोमल कोशिकाओं की सक्रियता38,39 होती है।
गामा विकिरण कैंसर के उपचार में एक मूल्यवान चिकित्सीय उपकरण है, खासकर कोलोरेक्टल ट्यूमर40 के लिए। हालांकि, विकिरण कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाकर आंतों के होमियोस्टैसिस को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करता है, जिससे एपोप्टोसिस होता है। विकिरण जोखिम कई गड़बड़ियों का कारण बनता है जो रोगी की वसूली को धीमा कर देता है और तीव्र चरण में म्यूकोसल चोट और सूजन और दस्त, असंयम, रक्तस्राव और पेट दर्द द्वारा चिह्नित होता है। अभिव्यक्तियों के इस पैनोपली को गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकिरण विषाक्तता के रूप में जाना जाता है। इसके अतिरिक्त, ट्रांसम्यूरल फाइब्रोसिस और / या संवहनी स्क्लेरोसिस की विकिरण-प्रेरित प्रगति केवल उपचार38,41 के बाद ही प्रकट हो सकती है। चोट के साथ-साथ, विकिरण आंतों की कोशिकाओं में एक मरम्मत प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है जो पुनर्जनन शुरू करने और व्यवस्थित करने के लिए जिम्मेदार सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करताहै। विकिरण-प्रेरित छोटे आंत्र रोग अन्य अंगों (जैसे गर्भाशय ग्रीवा, प्रोस्टेट, अग्न्याशय, मलाशय) को प्रदान की गई पैल्विक या पेट रेडियोथेरेपी से उत्पन्न हो सकते हैं 41,43,44,45,46। आंतों के विकिरण की चोट, इस प्रकार, एक महत्वपूर्ण नैदानिक मुद्दा है, और परिणामस्वरूप पैथोफिज़ियोलॉजी की बेहतर समझ रेडियोथेरेपी से जुड़ी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल जटिलताओं को कम करने के लिए हस्तक्षेप के विकास को आगे बढ़ाने की संभावना है। अन्य तकनीकें हैं जो विकिरण के अलावा आंतों के उपकला के पुनर्योजी उद्देश्य की जांच करने की अनुमति देती हैं। सूजन और उसके बाद पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए ट्रांसजेनिक और रासायनिक मुराइन मॉडल विकसितकिए गए हैं। डेक्सट्रान सोडियम सल्फेट (डीएसएस) आंत में सूजन को प्रेरित करता है और सूजन आंत्र रोग के समान विशेषताओं के विकास की ओर जाताहै। प्रो-कार्सिनोजेनिक यौगिक एज़ोक्सीमेथेन (एओएम) के साथ डीएसएस उपचार के संयोजन के परिणामस्वरूप कोलाइटिस से जुड़े कैंसर48,49 का विकास हो सकता है। इस्केमिया रीपरफ्यूजन-प्रेरित चोट आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए नियोजित एक और विधि है। इस तकनीक के लिए अनुभव और शल्य चिकित्सा ज्ञान की आवश्यकता होतीहै। इसके अलावा, उपरोक्त तकनीकें विकिरण की तुलना में विभिन्न प्रकार की चोट का कारण बनती हैं और पुनर्जनन के विभिन्न तंत्रों की भागीदारी का कारण बन सकती हैं। इसके अलावा, ये मॉडल समय लेने वाले हैं, जबकि विकिरण तकनीक काफी संक्षिप्त है। हाल ही में, आंत और बृहदान्त्र से उत्पन्न एंटरोइड्स और कोलोनोइड्स का उपयोग करने वाले इन विट्रो तरीकों का उपयोग आंतों के पुनर्जनन51,52 के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विकिरण की चोट के साथ संयोजन में किया गया है। हालांकि, ये तकनीकें53,54 मॉडल के अंग को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करती हैं।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में एक आनुवंशिक मॉडल के साथ संयोजन में गामा-विकिरण चोट के एक मुराइन मॉडल का विवरण शामिल है, जो टैमोक्सीफेन उपचार के बाद, आरक्षित स्टेम सेल आबादी (बीएमआई 1-सीआरई ईआर) से उत्पन्न वंशावली का पता लगाने की अनुमति देताहै। Rosa26eYFP)। यह मॉडल 12 Gy कुल-शरीर विकिरण का उपयोग करता है, जो आरक्षित स्टेम कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण आंतों की चोट को प्रेरित करता है, जबकि अभी भी चोट के 7 दिनों के भीतर आंतों की पुनर्योजी क्षमता की बाद की जांच की अनुमतिदेता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

आंतों के उपकला में कोशिकाओं की एक एकल परत होती है, फिर भी इसमें कई प्रकार की टर्मिनल विभेदित कोशिकाएं होती हैं, जो आंतों के क्रिप्ट के तल पर स्थित आंतों की स्टेम कोशिकाओं के सक्रिय प्रसार से उत्पन्न होती हैं। हालांकि, तीव्र आंतों की चोट की घटनाओं के दौरान, ये सक्रिय आंतों की स्टेम कोशिकाएं कोशिका मृत्यु से गुजरती हैं। गामा विकिरण एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला कोलोरेक्टल कैंसर उपचार है, जो चिकित्सीय रूप से प्रभावोत्पादक होने के बावजूद, सक्रिय स्टेम सेल पूल को कम करने का दुष्प्रभाव है। दरअसल, सक्रिय स्टेम सेल की कमी के कारण रेडियोथेरेपी से गुजरते समय रोगियों को अक्सर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकिरण सिंड्रोम का अनुभव होता है। आंतों के क्रिप्ट्स में सक्रिय आंतों की स्टेम कोशिकाओं का नुकसान आमतौर पर क्विसेंट रिजर्व आंतों की स्टेम कोशिकाओं के एक पूल को सक्रिय करता है और स्रावी और एंटरोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं के विघटन को प्रेरित करता है। यदि इन कोशिकाओं के लिए नहीं, तो आंतों के उपकला में रेडियोथेरेपी और ऐसे अन्य प्रमुख ऊतक अपमान से उबरने की क्षमता की कमी होगी। वंश-अनुरेखण प्रौद्योगिकियों में नई प्रगति पुनर्जनन के दौरान कोशिकाओं के सक्रियण, भेदभाव और प्रवास की ट्रैकिंग की अनुमति देती है और आंत में इसका अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित की गई है। इस अध्ययन का उद्देश्य विकिरण की चोट के बाद माउस आंतों के उपकला के भीतर कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक विधि को चित्रित करना है।

मुराइन आनुवंशिक वंश अनुरेखण के साथ संयोजन में 12 जी कुल-शरीर विकिरण (टीबीआई) का उपयोग आंत में विकिरण की चोट के परिणामों के गहन विश्लेषण की अनुमति देता है। शुरू करने के लिए, बीएमआई1-सीआरई ईआर; रोसा 26ई...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट रेडियोथेरेप्यूटिक कैंसर उपचार पर चोट के लिए सबसे संवेदनशील अंगों में से एक है। यह एक साथ एक अंग प्रणाली है जिसमें इस तरह के अपमान के बाद उच्चतम पुनर्योजी क्षमताओं में से एक है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है।

आयनीकरण विकिरण के जवाब में आंतों के उपकला पुनर्जनन

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

गामा विकिरण कोलोरेक्टल कैंसर के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला उपचार है। और जब यह चिकित्सीय रूप से प्रभावोत्पादक है, तो इसका जठरांत्र संबंधी मार्ग पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल विकिरण की चोट के बाद पुनर्जनन के दौरान कोशिकाओं के सक्रियण, भेदभाव और प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है।यह प्रोटोकॉल एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकिरण चोट मॉडल का वर्णन करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह मॉडल चोट के बाद आंतों के सेल भाग्य को ट्रैक करने की अनुमति देता है और इस प्रकार विशिष्ट सेल उप-जनसंख्या की पुनर्योजी क्षमता की बेहतर समझ प्रदान करता है। यह तकनीक वास्तविक समय के व्यवहार और चोट के बाद कोशिकाओं की विभिन्न उप-आबादी की बातचीत का अध्ययन करने के लिए अलग-अलग वंश-अनुरेखण पशु मॉडल को नियोजित कर सकती है।इस प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों को विकिरण की चोट पर माइक्रोबायोटा और विभिन्न उपकला, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के बीच संबंधों की जांच की अनुमति देनी चाहिए। शुरू करने के लिए, बाँझ मकई के तेल में 30 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की एकाग्रता पर टैमोक्सीफेन पाउडर को फिर से निलंबित करें। 60% आयाम के साथ 30 सेकंड के ऑन-ऑफ चक्रों में तीन मिनट के लिए सोनिकेट करें।कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए अंधेरे में रोटेशन द्वारा मिलाएं। फिर, ईडीयू पाउडर में बाँझ डीएमएसओ जोड़कर ईडीयू तैयार करें। कुल आयतन का 1/5 जोड़ें, और धीरे-धीरे बाँझ अल्ट्राप्योर पानी की शेष मात्रा जोड़ें।जब पूरी तरह से घुल जाता है, तो एलिकोट करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ऊतक संग्रह और निर्धारण के लिए अभिकर्मक तैयार करें, जैसे कि पानी में 70% इथेनॉल, डीपीबीएस चार डिग्री सेल्सियस तक ठंडा, बौइन का फिक्सेटिव बफर और 10% बफर्ड फॉर्मेलिन। इसके बाद, आवश्यक उपकरण तैयार करें, जैसे कि चूहों की विच्छेदन किट, पेट्री व्यंजन, 10 मिलीलीटर सिरिंज और हिस्टोलॉजिकल कैसेट से जुड़ी 16-गेज गैवेज सुई।गामा विकिरण जोखिम से दो दिन पहले, टैमोक्सीफेन इंजेक्शन के लिए प्रयोगात्मक जानवरों को तैयार करें। प्रत्येक जानवर का वजन करें, और आवश्यक खुराक की गणना करें। 70% इथेनॉल के साथ पेट के क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।फिर, क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन को प्रेरित करने के लिए एक-मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 27-गेज सुई का उपयोग करके टैमोक्सीफेन इंट्रापेरिटोनियल की एक खुराक का प्रशासन करें। संभावित टैमोक्सीफेन विषाक्तता को बाहर करने के लिए अगले 48 घंटों के लिए जानवरों का निरीक्षण करें। 48 घंटों के बाद, जानवरों को विकिरण कक्ष में स्थानांतरित करें।70% इथेनॉल समाधान के साथ गामा इरेडिएटर में नमूना कक्ष को कीटाणुरहित करें। नमूना कक्ष के अंदर शोषक मैट और जानवरों को रखें। ढक्कन रखें, और कक्ष बंद करें।गामा इरेडिएटर को जानवरों को 12 ग्रे कुल शरीर विकिरण के लिए उजागर करने के लिए प्रोग्राम करें। फिर, कुंजी को प्रारंभ स्थिति में घुमाएं, और एक्सपोज़र शुरू करने के लिए प्रारंभ दबाएं। सक्रिय एक्सपोजर समय के लिए कमरे को छोड़ दें।पूर्व निर्धारित समय बीत जाने के बाद, मशीन स्वचालित रूप से बंद हो जाएगी और बीपिंग शुरू कर देगी। कुंजी को स्टॉप स्थिति में बदलकर मशीन को बंद करें। नमूना कक्ष खोलें, और ढक्कन उतारें।जानवरों को पिंजरे में स्थानांतरित करें, और 70% इथेनॉल के साथ नमूना कक्ष को कीटाणुरहित करें। जानवरों को पारंपरिक आवास कक्ष में वापस स्थानांतरित करें, और उपचार के बाद उनकी स्थिति का निरीक्षण करें। हर दिन जानवरों के वजन की निगरानी करें।नियोजित इच्छामृत्यु से तीन घंटे पहले, पेट के क्षेत्र को कीटाणुरहित करें, और चूहों को 28-गेज इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके ईडीयू स्टॉक समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। जानवर को यूथेनाइज़ करने के बाद, विकिरण के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर समीपस्थ आंतों को इकट्ठा करें। छोटी आंत के समीपस्थ भाग को विच्छेदित करें, और संलग्न ऊतकों को हटा दें।10-मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 16-गेज सीधी फीडिंग सुई का उपयोग करके ठंडे डीपीबीएस के साथ ऊतक को फ्लश करें, और बौइन के फिक्सेटिव बफर के साथ ऊतक को ठीक करें। आंतों को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें, और स्विस-रोल तकनीक का उपयोग करके समीपस्थ आंतों को रोल करें। ऊतकों को 10% बफर फॉर्मेलिन के साथ एक कंटेनर में हिस्टोलॉजिकल कैसेट में रखें, और इसे कमरे के तापमान पर 24 से 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, हिस्टोलॉजिकल कैसेट को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें, और ऊतक को पैराफिन में एम्बेड करें। एम्बेड करने के बाद, हिस्टोलॉजिकल कैसेट को कम से कम एक घंटे के लिए बर्फ पर रखें। फिर, एक माइक्रोटोम का उपयोग करके पांच-माइक्रोन-मोटी क्षैतिज खंडों को काटें।ऊतक वर्गों को 45 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान में स्थानांतरित करें, और अनुभागों को चार्ज स्लाइड पर रखें। स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर रात भर रैक पर सूखने के लिए छोड़ दें। छोटी आंत के नमूनों की हेमटोक्सिलिन और ईओसिन छवियों ने शून्य घंटे में एक होमियोस्टैटिक आंतों के उपकला को दिखाया, इसके बाद एपोप्टोटिक चरण के दौरान क्रिप्ट डिब्बों के भीतर कोशिकाओं का नुकसान हुआ।इसके बाद पुनर्योजी चरण आया जिसमें अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं ने क्रिप्ट्स को आबाद किया, जिससे सातवें दिन तक सामान्यीकरण चरण हुआ। ईवाईएफपी द्वारा वंश अनुरेखण से पता चला है कि होमियोस्टैसिस के दौरान, बीएमआई 1 पॉजिटिव रिजर्व स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न कोशिकाएं क्रिप्ट्स के भीतर प्लस चार से प्लस छह पदों तक सीमित थीं। ईडीयू और केआई -67 धुंधला होने से शाम विकिरणित चूहों में सामान्य आंतों के होमियोस्टैसिस दिखाई दिए, जो सक्रिय स्टेम कोशिकाओं से पारगमन-प्रवर्धन क्षेत्र के माध्यम से फैले हुए थे।एपोप्टोटिक चरण के दौरान, ईवाईएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में कमी आई, विकिरण क्षति के कारण प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के नुकसान के साथ। पुनर्योजी चरण में, आरक्षित स्टेम कोशिकाओं की सक्रियता और बीएमआई 1-पॉजिटिव कोशिकाओं का तेजी से प्रसार देखा गया। आगे प्रसार और प्रवासन ने आंतों के उपकला अखंडता को बहाल किया।ट्यूनल धुंधला होने से पता चला कि होमोस्टेसिस के दौरान एपोप्टोटिक कोशिकाएं अनुपस्थित हैं। एपोप्टोटिक चरण में देर से ट्यूनल धुंधलापन में वृद्धि देखी गई थी। पुनर्योजी चरण के दौरान, ट्यूनल धुंधलापन पुनर्जनन क्रिप्ट्स के भीतर लगातार कम हो गया और क्रिप्ट्स के सामान्य होने पर लगभग अनुपस्थित था।इस तकनीक को आरएनए अनुक्रमण, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग, या प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि चोट के बाद आंतों के पुनर्जनन के दौरान विशिष्ट सेल वंश की भूमिका के बारे में अधिक गहन ज्ञान प्राप्त किया जा सके। शोधकर्ता आंतों के उपकला की पुनर्योजी क्षमता की समझ का विस्तार करने के लिए आंत पुनर्जनन में माइक्रोबायोटा और उपकला, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के बीच बातचीत की जांच कर सकते हैं।

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Cortical Neurogenesis: प्रयोगशाला में अग्रिम से सेल आधारित चिकित्सा में संक्रमण

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

ΓH2AX foci के Ionising विकिरण करने के लिए प्रत्युत्तर में मात्रा का ठहराव

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

विकिरण के बाद γH2AX के स्थानिक वितरण का मूल्यांकन

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

न्यूट में लेंस पुनर्जनन अध्ययन संवर्धन परितारिका वर्णक उपकला कोशिकाओं के लिए एक प्रणाली

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebrafish Pronephros के लेजर एबलेशन गुर्दे उपकला पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

शाही सेना शोधन द्वारा chromatin अलगाव (कूजन)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

बाल उत्थान के दौरान तेजी से उपकला-mesenchymal संकेतन की आनुवांशिक विश्लेषण

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

हाइड्रा में glutathione प्रेरित दूध पिलाने की प्रतिक्रिया को मापने

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

इन विट्रो में और Vivo में आंतों उपकला कोशिका पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.