Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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Gli autori desiderano riconoscere lo Stony Brook Cancer Center Histology Research Core per l'assistenza di esperti nella preparazione dei campioni di tessuto e la Divisione delle risorse animali da laboratorio presso la Stony Brook University per l'assistenza nella cura e nella gestione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health DK124342 assegnate ad Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Tutti i topi sono stati ospitati nella Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) della Stony Brook University. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stony Brook University (IACUC) ha approvato tutti gli studi e le procedure che coinvolgono soggetti animali. Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti rigorosamente in conformità con il protocollo di gestione degli animali approvato (IACUC # 245094).
NOTA: I ceppi di topo B6;129-Bmi1 tm1...

Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. Consente l'analisi precisa dei cambiamenti nell'epitelio intestinale nel corso di 7 giorni dopo l'infortunio. È importante sottolineare che i punti temporali selezionati riflettono fasi cruciali della lesione e sono caratterizzati da distinte alterazioni dell'intestino (lesioni, apoptosi, rigenerazione e fasi di normalizzazione)60. Questo modello di irradiazione è stato stabilito e attentamente valutato, dimost...

L'epitelio intestinale umano coprirebbe approssimativamente la superficie di mezzo campo da badminton se posizionato completamente piatto1. Invece, questo singolo strato cellulare che separa gli esseri umani dal contenuto delle loro viscere è compattato in una serie di proiezioni simili a dita, villi e rientranze, cripte che massimizzano la superficie dell'intestino. Le cellule dell'epitelio si differenziano lungo un asse crypt-villus. I villi sono costituiti principalmente da enterociti che assorbono i nutrienti, cellule caliciformi che secernono muco e cellule enteroendocrine che producono ormoni, mentre le cripte consistono principalmente di cellule di Paneth produttrici di defensina, cellule staminali attive e di riserva e cellule progenitrici 2,3,4,5. Inoltre, la comunicazione bidirezionale che queste cellule hanno con le cellule stromali e immunitarie del compartimento mesenchimale sottostante e il microbiota del lume generano una complessa rete di interazioni che mantiene l'omeostasi intestinale ed è fondamentale per il recupero dopo l'infortunio 6,7,8.
L'epitelio intestinale è il tessuto auto-rinnovante più rapidamente nel corpo umano, con un tasso di turnover di 2-6 giorni 9,10,11. Durante l'omeostasi, le cellule staminali attive alla base delle cripte intestinali (cellule colonnari della base della cripta), contrassegnate dall'espressione del recettore 5 accoppiato alla proteina G contenente ripetizioni ricco di leucina (LGR5), si dividono rapidamente e forniscono cellule progenitrici che si differenziano in tutte le altre linee epiteliali intestinali. Tuttavia, a causa del loro alto tasso mitotico, le cellule staminali attive e i loro progenitori immediati sono particolarmente sensibili alle lesioni da radiazioni gamma e subiscono apoptosi dopo irradiazione 5,12,13,14. Alla loro perdita, le cellule staminali di riserva e le cellule non staminali (sottopopolazioni di progenitori e alcune cellule terminalmente differenziate) all'interno delle cripte intestinali subiscono l'attivazione e ricostituiscono il compartimento della cripta basale, che può quindi ricostituire le popolazioni cellulari dei villi e, quindi, rigenerare l'epitelio intestinale15. Utilizzando tecniche di tracciamento del lignaggio, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che le cellule staminali di riserva (quiescenti) sono in grado di supportare la rigenerazione dopo la perdita di cellule staminali attive 13,16,17,18,19,20,21,22. Queste cellule sono caratterizzate dalla presenza dell'oncogene della proteina 1 del complesso polycomb (Bmi1), del gene della trascrittasi inversa della telomerasi di topo (mTert), dell'omeobox Hop (Hopx) e del gene della proteina 1 di ripetizione ricco di leucina (Lrig1). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule non staminali sono in grado di ricostituire le cripte intestinali in caso di lesioni 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In particolare, è stato dimostrato che i progenitori delle cellule secretorie e degli enterociti subiscono una dedifferenziazione in caso di lesione, ritornano a cellule staminali e supportano la rigenerazione dell'epitelio intestinale. Studi recenti hanno identificato cellule che esprimono marcatori multipli che possiedono la capacità di acquisire caratteristiche simili a staminali in caso di lesione (come DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. hanno dimostrato che anche le cellule di Paneth mature (LYZ +) possono contribuire alla rigenerazione intestinale37. Inoltre, oltre a causare l'apoptosi delle cellule epiteliali intestinali e ad interrompere la funzione della barriera epiteliale, l'irradiazione provoca disbiosi della flora intestinale, attivazione delle cellule immunitarie e inizio di una risposta pro-infiammatoria e attivazione delle cellule mesenchimali e stromali38,39.
La radiazione gamma è un prezioso strumento terapeutico nel trattamento del cancro, soprattutto per i tumori del colon-retto40. Tuttavia, l'irradiazione influisce significativamente sull'omeostasi intestinale inducendo danni alle cellule, che portano all'apoptosi. L'esposizione alle radiazioni provoca molteplici perturbazioni che rallentano il recupero di un paziente ed è caratterizzata da lesioni e infiammazioni della mucosa nella fase acuta e diarrea, incontinenza, sanguinamento e dolore addominale a lungo termine. Questa panoplia di manifestazioni è indicata come tossicità da radiazioni gastrointestinali. Inoltre, la progressione indotta dalle radiazioni della fibrosi transmurale e/o della sclerosi vascolare può manifestarsi solo anni dopo il trattamento38,41. Contemporaneamente alla lesione stessa, la radiazione induce una risposta di riparazione nelle cellule intestinali che attiva le vie di segnalazione responsabili dell'avvio e dell'orchestrazione della rigenerazione42. La malattia dell'intestino tenue indotta da radiazioni può originarsi dalla radioterapia pelvica o addominale fornita ad altri organi (come cervice, prostata, pancreas, retto)41,43,44,45,46. Il danno da irradiazione intestinale è, quindi, un problema clinico significativo e una migliore comprensione della fisiopatologia risultante è probabile che faccia avanzare lo sviluppo di interventi per alleviare le complicanze gastrointestinali associate alla radioterapia. Esistono altre tecniche che consentono di indagare lo scopo rigenerativo dell'epitelio intestinale oltre alle radiazioni. Sono stati sviluppati modelli murini transgenici e chimici per studiare l'infiammazione e la successiva rigenerazione47. Il destrano solfato di sodio (DSS) induce infiammazione nell'intestino e porta allo sviluppo di caratteristiche simili a quelle della malattia infiammatoria intestinale48. Una combinazione di trattamento DSS con il composto pro-cancerogeno azoxymethane (AOM) può provocare lo sviluppo di cancro associato alla colite48,49. La lesione indotta da ischemia da riperfusione è un altro metodo impiegato per studiare il potenziale rigenerativo dell'epitelio intestinale. Questa tecnica richiede esperienza e conoscenza chirurgica50. Inoltre, le suddette tecniche causano diversi tipi di lesioni rispetto alle radiazioni e possono portare al coinvolgimento di diversi meccanismi di rigenerazione. Inoltre, questi modelli richiedono molto tempo, mentre la tecnica di radiazione è abbastanza breve. Recentemente, metodi in vitro che utilizzano enteroidi e colonoidi generati dall'intestino e dal colon sono stati utilizzati in combinazione con lesioni da radiazioni per studiare i meccanismi di rigenerazione intestinale51,52. Tuttavia, queste tecniche non ricapitolano completamente l'organo che modellano53,54.
Il protocollo presentato include la descrizione di un modello murino di danno da radiazioni gamma in combinazione con un modello genetico che, a seguito del trattamento con tamoxifene, consente di tracciare linee originate dalla popolazione di cellule staminali di riserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Questo modello utilizza un'irradiazione totale corporea di 12 Gy, che induce lesioni intestinali abbastanza significative da attivare le cellule staminali di riserva, consentendo comunque la successiva indagine della capacità rigenerativa intestinale entro 7 giorni dalla lesione55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

L'epitelio intestinale è costituito da un singolo strato di cellule ma contiene più tipi di cellule terminalmente differenziate, che sono generate dalla proliferazione attiva delle cellule staminali intestinali situate sul fondo delle cripte intestinali. Tuttavia, durante gli eventi di danno intestinale acuto, queste cellule staminali intestinali attive subiscono la morte cellulare. L'irradiazione gamma è un trattamento del cancro del colon-retto ampiamente utilizzato che, sebbene terapeuticamente efficace, ha l'effetto collaterale di esaurire il pool di cellule staminali attive. Infatti, i pazienti sperimentano frequentemente la sindrome da radiazioni gastrointestinali durante la radioterapia, in parte a causa della deplezione di cellule staminali attive. La perdita di cellule staminali intestinali attive nelle cripte intestinali attiva un pool di cellule staminali intestinali di riserva tipicamente quiescenti e induce la dedifferenziazione delle cellule precursori secretorie ed enterocitarie. Se non fosse per queste cellule, l'epitelio intestinale mancherebbe della capacità di recuperare dalla radioterapia e da altri importanti insulti tissutali. I nuovi progressi nelle tecnologie di tracciamento del lignaggio consentono il monitoraggio dell'attivazione, della differenziazione e della migrazione delle cellule durante la rigenerazione e sono stati impiegati con successo per studiarlo nell'intestino. Questo studio mira a rappresentare un metodo per l'analisi delle cellule all'interno dell'epitelio intestinale del topo dopo lesioni da radiazioni.

L'uso dell'irradiazione totale corporea (TBI) a 12 Gy in combinazione con il tracciamento del lignaggio genetico murino consente un'analisi approfondita delle conseguenze delle lesioni da radiazioni nell'intestino. Per iniziare, Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una singola iniezione di tamoxifene, che induce una maggiore espressione di proteine fluorescenti gialle (EYFP) all'interno di una popolazione di cellule staminali di riserva Bmi1+ . Due giorni dopo l'iniezione...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Il tratto gastrointestinale è uno degli organi più sensibili alle lesioni sui trattamenti radioterapeutici contro il cancro. È allo stesso tempo un sistema di organi con una delle più alte capacità rigenerative a seguito di tali insulti. Il protocollo presentato descrive un metodo efficace per studiare la capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

L'irradiazione gamma è un trattamento ampiamente usato per il cancro del colon-retto. E mentre è terapeuticamente efficace, ha effetti negativi sul tratto gastrointestinale. Il protocollo presentato descrive un metodo efficiente per studiare l'attivazione, la differenziazione e la migrazione delle cellule durante la rigenerazione dopo lesioni da radiazioni.Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. È importante sottolineare che questo modello consente di tracciare il destino delle cellule intestinali dopo la lesione e quindi fornisce una migliore comprensione della capacità rigenerativa di specifiche sottopopolazioni cellulari. Questa tecnica può impiegare modelli animali distinti per studiare il comportamento in tempo reale e l'interazione di varie sottopopolazioni di cellule post-lesione.Piccole modifiche a questo protocollo dovrebbero consentire lo studio delle relazioni tra microbiota e diverse popolazioni di cellule epiteliali, stromali e immunitarie in caso di danno da radiazioni. Per iniziare, risospendere la polvere di tamoxifene in olio di mais sterile ad una concentrazione di 30 microgrammi per microlitro. Sonica per tre minuti in cicli on-off di 30 secondi con un'ampiezza del 60%.Mescolare ruotando al buio per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, preparare EdU aggiungendo DMSO sterile alla polvere EdU. Aggiungere 1/5 del volume totale e aggiungere lentamente il volume rimanente di acqua ultrapura sterile.Quando completamente sciolto, aliquote e conservare a 20 gradi Celsius. Preparare i reagenti per la raccolta e la fissazione dei tessuti, come il 70% di etanolo in acqua, DPBS raffreddato a quattro gradi Celsius, tampone fissativo di Bouin e formalina tamponata al 10%. Quindi, preparare l'attrezzatura necessaria, come un kit di dissezione dei topi, piastre di Petri, un ago da gavage calibro 16 collegato a una siringa da 10 millilitri e cassette istologiche.Due giorni prima dell'esposizione all'irradiazione gamma, preparare gli animali da esperimento per l'iniezione di tamoxifene. Pesare ogni animale e calcolare il dosaggio richiesto. Disinfettare la zona addominale con etanolo al 70%.Quindi, somministrare una singola dose di tamoxifene per via intraperitoneale utilizzando un ago da 27 gauge collegato a una siringa da un millilitro per indurre la ricombinazione mediata da Cre. Osservare gli animali per le prossime 48 ore per escludere la potenziale tossicità del tamoxifene. Dopo 48 ore, trasferire gli animali nella stanza di irradiazione.Disinfettare la camera del campione nell'irradiatore gamma con una soluzione di etanolo al 70%. Posizionare il tappetino assorbente e gli animali all'interno della camera del campione. Posizionare il coperchio e chiudere la camera.Programmare l'irradiatore gamma per esporre gli animali a 12 irradiazioni grigie del corpo totale. Quindi, ruotare la chiave sulla posizione iniziale e premere start per avviare l'esposizione. Lasciare la stanza per il tempo di esposizione attiva.Trascorso il tempo preimpostato, la macchina si arresterà automaticamente e inizierà a emettere un segnale acustico. Spegnere la macchina ruotando la chiave nella posizione di arresto. Aprire la camera del campione e togliere il coperchio.Trasferire gli animali nella gabbia e disinfettare la camera del campione con etanolo al 70%. Trasferire gli animali nella stanza di stabulazione convenzionale e osservare le loro condizioni dopo il trattamento. Monitorare il peso degli animali ogni giorno.Tre ore prima dell'eutanasia pianificata, disinfettare l'area addominale e iniettare i topi per via intraperitoneale con 100 microlitri di soluzione madre di EdU utilizzando una siringa da insulina da 28 gauge. Dopo l'eutanasia dell'animale, raccogliere gli intestini prossimali in diversi punti temporali post-irradiazione. Sezionare la parte prossimale dell'intestino tenue e rimuovere i tessuti attaccati.Lavare il tessuto con DPBS freddo utilizzando un ago di alimentazione dritto calibro 16 collegato a una siringa da 10 millilitri e fissare il tessuto con il tampone fissativo di Bouin. Tagliare l'intestino aperto longitudinalmente e arrotolare l'intestino prossimale usando la tecnica Swiss-roll. Mettere i tessuti in una cassetta istologica in un contenitore con formalina tamponata al 10% e incubarlo per 24-48 ore a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, trasferire le cassette istologiche al 70% di etanolo e incorporare il tessuto in paraffina. Dopo l'incorporazione, posizionare le cassette istologiche sul ghiaccio per almeno un'ora. Quindi, tagliare sezioni orizzontali spesse cinque micron usando un microtomo.Trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldata fino a 45 gradi Celsius e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente. Le immagini di ematossilina ed eosina di campioni di intestino tenue hanno mostrato un epitelio intestinale omeostatico all'ora zero, seguito dalla perdita di cellule all'interno dei compartimenti della cripta durante la fase apoptotica.Questo è stato seguito dalla fase rigenerativa in cui cellule altamente proliferative popolavano le cripte, portando alla fase di normalizzazione entro il settimo giorno. Il tracciamento del lignaggio da parte dell'EYFP ha mostrato che durante l'omeostasi, le cellule provenienti da cellule staminali di riserva positive al Bmi1 erano limitate alle posizioni da quattro a più sei all'interno delle cripte. La colorazione di EdU e Ki-67 ha mostrato una normale omeostasi intestinale nei topi irradiati fittizi, che si estende dalle cellule staminali attive attraverso la zona di amplificazione del transito.Durante la fase apoptotica, il numero di cellule EYFP-positive è diminuito, accompagnato da una perdita di cellule proliferative causata da danni da radiazioni. Nella fase rigenerativa è stata osservata l'attivazione delle cellule staminali di riserva e la rapida proliferazione delle cellule Bmi1-positive. L'ulteriore proliferazione e migrazione ha ripristinato l'integrità dell'epitelio intestinale.La colorazione TUNEL ha mostrato che le cellule apoptotiche sono assenti durante l'omeostasi. Un aumento della colorazione TUNEL è stato osservato verso la fine della fase apoptotica. Durante la fase rigenerativa, la colorazione TUNEL è diminuita costantemente all'interno delle cripte rigeneranti ed è stata quasi assente quando le cripte si sono normalizzate.Questa tecnica può essere combinata con il sequenziamento dell'RNA, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o l'analisi proteomica per raccogliere conoscenze più approfondite sul ruolo di specifiche linee cellulari durante la rigenerazione intestinale dopo la lesione. I ricercatori possono studiare le interazioni tra microbiota e popolazioni di cellule epiteliali, stromale e immunitarie nella rigenerazione intestinale per espandere la comprensione della capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenesi corticale: Transizione dai progressi nel laboratorio di terapie basate sulle cellule

Ricerca

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.