Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Gli autori desiderano riconoscere lo Stony Brook Cancer Center Histology Research Core per l'assistenza di esperti nella preparazione dei campioni di tessuto e la Divisione delle risorse animali da laboratorio presso la Stony Brook University per l'assistenza nella cura e nella gestione degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health DK124342 assegnate ad Agnieszka B. Bialkowska e DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Tutti i topi sono stati ospitati nella Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) della Stony Brook University. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Stony Brook University (IACUC) ha approvato tutti gli studi e le procedure che coinvolgono soggetti animali. Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti rigorosamente in conformità con il protocollo di gestione degli animali approvato (IACUC # 245094).
NOTA: I ceppi di topo B6;129-Bmi1 tm1...

Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. Consente l'analisi precisa dei cambiamenti nell'epitelio intestinale nel corso di 7 giorni dopo l'infortunio. È importante sottolineare che i punti temporali selezionati riflettono fasi cruciali della lesione e sono caratterizzati da distinte alterazioni dell'intestino (lesioni, apoptosi, rigenerazione e fasi di normalizzazione)60. Questo modello di irradiazione è stato stabilito e attentamente valutato, dimost...

L'epitelio intestinale umano coprirebbe approssimativamente la superficie di mezzo campo da badminton se posizionato completamente piatto1. Invece, questo singolo strato cellulare che separa gli esseri umani dal contenuto delle loro viscere è compattato in una serie di proiezioni simili a dita, villi e rientranze, cripte che massimizzano la superficie dell'intestino. Le cellule dell'epitelio si differenziano lungo un asse crypt-villus. I villi sono costituiti principalmente da enterociti che assorbono i nutrienti, cellule caliciformi che secernono muco e cellule enteroendocrine che producono ormoni, mentre le cripte consistono principalmente di cellule di Paneth produttrici di defensina, cellule staminali attive e di riserva e cellule progenitrici 2,3,4,5. Inoltre, la comunicazione bidirezionale che queste cellule hanno con le cellule stromali e immunitarie del compartimento mesenchimale sottostante e il microbiota del lume generano una complessa rete di interazioni che mantiene l'omeostasi intestinale ed è fondamentale per il recupero dopo l'infortunio 6,7,8.
L'epitelio intestinale è il tessuto auto-rinnovante più rapidamente nel corpo umano, con un tasso di turnover di 2-6 giorni 9,10,11. Durante l'omeostasi, le cellule staminali attive alla base delle cripte intestinali (cellule colonnari della base della cripta), contrassegnate dall'espressione del recettore 5 accoppiato alla proteina G contenente ripetizioni ricco di leucina (LGR5), si dividono rapidamente e forniscono cellule progenitrici che si differenziano in tutte le altre linee epiteliali intestinali. Tuttavia, a causa del loro alto tasso mitotico, le cellule staminali attive e i loro progenitori immediati sono particolarmente sensibili alle lesioni da radiazioni gamma e subiscono apoptosi dopo irradiazione 5,12,13,14. Alla loro perdita, le cellule staminali di riserva e le cellule non staminali (sottopopolazioni di progenitori e alcune cellule terminalmente differenziate) all'interno delle cripte intestinali subiscono l'attivazione e ricostituiscono il compartimento della cripta basale, che può quindi ricostituire le popolazioni cellulari dei villi e, quindi, rigenerare l'epitelio intestinale15. Utilizzando tecniche di tracciamento del lignaggio, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che le cellule staminali di riserva (quiescenti) sono in grado di supportare la rigenerazione dopo la perdita di cellule staminali attive 13,16,17,18,19,20,21,22. Queste cellule sono caratterizzate dalla presenza dell'oncogene della proteina 1 del complesso polycomb (Bmi1), del gene della trascrittasi inversa della telomerasi di topo (mTert), dell'omeobox Hop (Hopx) e del gene della proteina 1 di ripetizione ricco di leucina (Lrig1). Inoltre, è stato dimostrato che le cellule non staminali sono in grado di ricostituire le cripte intestinali in caso di lesioni 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In particolare, è stato dimostrato che i progenitori delle cellule secretorie e degli enterociti subiscono una dedifferenziazione in caso di lesione, ritornano a cellule staminali e supportano la rigenerazione dell'epitelio intestinale. Studi recenti hanno identificato cellule che esprimono marcatori multipli che possiedono la capacità di acquisire caratteristiche simili a staminali in caso di lesione (come DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. hanno dimostrato che anche le cellule di Paneth mature (LYZ +) possono contribuire alla rigenerazione intestinale37. Inoltre, oltre a causare l'apoptosi delle cellule epiteliali intestinali e ad interrompere la funzione della barriera epiteliale, l'irradiazione provoca disbiosi della flora intestinale, attivazione delle cellule immunitarie e inizio di una risposta pro-infiammatoria e attivazione delle cellule mesenchimali e stromali38,39.
La radiazione gamma è un prezioso strumento terapeutico nel trattamento del cancro, soprattutto per i tumori del colon-retto40. Tuttavia, l'irradiazione influisce significativamente sull'omeostasi intestinale inducendo danni alle cellule, che portano all'apoptosi. L'esposizione alle radiazioni provoca molteplici perturbazioni che rallentano il recupero di un paziente ed è caratterizzata da lesioni e infiammazioni della mucosa nella fase acuta e diarrea, incontinenza, sanguinamento e dolore addominale a lungo termine. Questa panoplia di manifestazioni è indicata come tossicità da radiazioni gastrointestinali. Inoltre, la progressione indotta dalle radiazioni della fibrosi transmurale e/o della sclerosi vascolare può manifestarsi solo anni dopo il trattamento38,41. Contemporaneamente alla lesione stessa, la radiazione induce una risposta di riparazione nelle cellule intestinali che attiva le vie di segnalazione responsabili dell'avvio e dell'orchestrazione della rigenerazione42. La malattia dell'intestino tenue indotta da radiazioni può originarsi dalla radioterapia pelvica o addominale fornita ad altri organi (come cervice, prostata, pancreas, retto)41,43,44,45,46. Il danno da irradiazione intestinale è, quindi, un problema clinico significativo e una migliore comprensione della fisiopatologia risultante è probabile che faccia avanzare lo sviluppo di interventi per alleviare le complicanze gastrointestinali associate alla radioterapia. Esistono altre tecniche che consentono di indagare lo scopo rigenerativo dell'epitelio intestinale oltre alle radiazioni. Sono stati sviluppati modelli murini transgenici e chimici per studiare l'infiammazione e la successiva rigenerazione47. Il destrano solfato di sodio (DSS) induce infiammazione nell'intestino e porta allo sviluppo di caratteristiche simili a quelle della malattia infiammatoria intestinale48. Una combinazione di trattamento DSS con il composto pro-cancerogeno azoxymethane (AOM) può provocare lo sviluppo di cancro associato alla colite48,49. La lesione indotta da ischemia da riperfusione è un altro metodo impiegato per studiare il potenziale rigenerativo dell'epitelio intestinale. Questa tecnica richiede esperienza e conoscenza chirurgica50. Inoltre, le suddette tecniche causano diversi tipi di lesioni rispetto alle radiazioni e possono portare al coinvolgimento di diversi meccanismi di rigenerazione. Inoltre, questi modelli richiedono molto tempo, mentre la tecnica di radiazione è abbastanza breve. Recentemente, metodi in vitro che utilizzano enteroidi e colonoidi generati dall'intestino e dal colon sono stati utilizzati in combinazione con lesioni da radiazioni per studiare i meccanismi di rigenerazione intestinale51,52. Tuttavia, queste tecniche non ricapitolano completamente l'organo che modellano53,54.
Il protocollo presentato include la descrizione di un modello murino di danno da radiazioni gamma in combinazione con un modello genetico che, a seguito del trattamento con tamoxifene, consente di tracciare linee originate dalla popolazione di cellule staminali di riserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Questo modello utilizza un'irradiazione totale corporea di 12 Gy, che induce lesioni intestinali abbastanza significative da attivare le cellule staminali di riserva, consentendo comunque la successiva indagine della capacità rigenerativa intestinale entro 7 giorni dalla lesione55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

L'epitelio intestinale è costituito da un singolo strato di cellule ma contiene più tipi di cellule terminalmente differenziate, che sono generate dalla proliferazione attiva delle cellule staminali intestinali situate sul fondo delle cripte intestinali. Tuttavia, durante gli eventi di danno intestinale acuto, queste cellule staminali intestinali attive subiscono la morte cellulare. L'irradiazione gamma è un trattamento del cancro del colon-retto ampiamente utilizzato che, sebbene terapeuticamente efficace, ha l'effetto collaterale di esaurire il pool di cellule staminali attive. Infatti, i pazienti sperimentano frequentemente la sindrome da radiazioni gastrointestinali durante la radioterapia, in parte a causa della deplezione di cellule staminali attive. La perdita di cellule staminali intestinali attive nelle cripte intestinali attiva un pool di cellule staminali intestinali di riserva tipicamente quiescenti e induce la dedifferenziazione delle cellule precursori secretorie ed enterocitarie. Se non fosse per queste cellule, l'epitelio intestinale mancherebbe della capacità di recuperare dalla radioterapia e da altri importanti insulti tissutali. I nuovi progressi nelle tecnologie di tracciamento del lignaggio consentono il monitoraggio dell'attivazione, della differenziazione e della migrazione delle cellule durante la rigenerazione e sono stati impiegati con successo per studiarlo nell'intestino. Questo studio mira a rappresentare un metodo per l'analisi delle cellule all'interno dell'epitelio intestinale del topo dopo lesioni da radiazioni.

L'uso dell'irradiazione totale corporea (TBI) a 12 Gy in combinazione con il tracciamento del lignaggio genetico murino consente un'analisi approfondita delle conseguenze delle lesioni da radiazioni nell'intestino. Per iniziare, Bmi1-CreER; I topi Rosa26eYFP hanno ricevuto una singola iniezione di tamoxifene, che induce una maggiore espressione di proteine fluorescenti gialle (EYFP) all'interno di una popolazione di cellule staminali di riserva Bmi1+ . Due giorni dopo l'iniezione...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Il tratto gastrointestinale è uno degli organi più sensibili alle lesioni sui trattamenti radioterapeutici contro il cancro. È allo stesso tempo un sistema di organi con una delle più alte capacità rigenerative a seguito di tali insulti. Il protocollo presentato descrive un metodo efficace per studiare la capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

Rigenerazione epiteliale intestinale in risposta all'irradiazione ionizzante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

L'irradiazione gamma è un trattamento ampiamente usato per il cancro del colon-retto. E mentre è terapeuticamente efficace, ha effetti negativi sul tratto gastrointestinale. Il protocollo presentato descrive un metodo efficiente per studiare l'attivazione, la differenziazione e la migrazione delle cellule durante la rigenerazione dopo lesioni da radiazioni.Questo protocollo descrive un modello di danno da radiazioni robusto e riproducibile. È importante sottolineare che questo modello consente di tracciare il destino delle cellule intestinali dopo la lesione e quindi fornisce una migliore comprensione della capacità rigenerativa di specifiche sottopopolazioni cellulari. Questa tecnica può impiegare modelli animali distinti per studiare il comportamento in tempo reale e l'interazione di varie sottopopolazioni di cellule post-lesione.Piccole modifiche a questo protocollo dovrebbero consentire lo studio delle relazioni tra microbiota e diverse popolazioni di cellule epiteliali, stromali e immunitarie in caso di danno da radiazioni. Per iniziare, risospendere la polvere di tamoxifene in olio di mais sterile ad una concentrazione di 30 microgrammi per microlitro. Sonica per tre minuti in cicli on-off di 30 secondi con un'ampiezza del 60%.Mescolare ruotando al buio per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, preparare EdU aggiungendo DMSO sterile alla polvere EdU. Aggiungere 1/5 del volume totale e aggiungere lentamente il volume rimanente di acqua ultrapura sterile.Quando completamente sciolto, aliquote e conservare a 20 gradi Celsius. Preparare i reagenti per la raccolta e la fissazione dei tessuti, come il 70% di etanolo in acqua, DPBS raffreddato a quattro gradi Celsius, tampone fissativo di Bouin e formalina tamponata al 10%. Quindi, preparare l'attrezzatura necessaria, come un kit di dissezione dei topi, piastre di Petri, un ago da gavage calibro 16 collegato a una siringa da 10 millilitri e cassette istologiche.Due giorni prima dell'esposizione all'irradiazione gamma, preparare gli animali da esperimento per l'iniezione di tamoxifene. Pesare ogni animale e calcolare il dosaggio richiesto. Disinfettare la zona addominale con etanolo al 70%.Quindi, somministrare una singola dose di tamoxifene per via intraperitoneale utilizzando un ago da 27 gauge collegato a una siringa da un millilitro per indurre la ricombinazione mediata da Cre. Osservare gli animali per le prossime 48 ore per escludere la potenziale tossicità del tamoxifene. Dopo 48 ore, trasferire gli animali nella stanza di irradiazione.Disinfettare la camera del campione nell'irradiatore gamma con una soluzione di etanolo al 70%. Posizionare il tappetino assorbente e gli animali all'interno della camera del campione. Posizionare il coperchio e chiudere la camera.Programmare l'irradiatore gamma per esporre gli animali a 12 irradiazioni grigie del corpo totale. Quindi, ruotare la chiave sulla posizione iniziale e premere start per avviare l'esposizione. Lasciare la stanza per il tempo di esposizione attiva.Trascorso il tempo preimpostato, la macchina si arresterà automaticamente e inizierà a emettere un segnale acustico. Spegnere la macchina ruotando la chiave nella posizione di arresto. Aprire la camera del campione e togliere il coperchio.Trasferire gli animali nella gabbia e disinfettare la camera del campione con etanolo al 70%. Trasferire gli animali nella stanza di stabulazione convenzionale e osservare le loro condizioni dopo il trattamento. Monitorare il peso degli animali ogni giorno.Tre ore prima dell'eutanasia pianificata, disinfettare l'area addominale e iniettare i topi per via intraperitoneale con 100 microlitri di soluzione madre di EdU utilizzando una siringa da insulina da 28 gauge. Dopo l'eutanasia dell'animale, raccogliere gli intestini prossimali in diversi punti temporali post-irradiazione. Sezionare la parte prossimale dell'intestino tenue e rimuovere i tessuti attaccati.Lavare il tessuto con DPBS freddo utilizzando un ago di alimentazione dritto calibro 16 collegato a una siringa da 10 millilitri e fissare il tessuto con il tampone fissativo di Bouin. Tagliare l'intestino aperto longitudinalmente e arrotolare l'intestino prossimale usando la tecnica Swiss-roll. Mettere i tessuti in una cassetta istologica in un contenitore con formalina tamponata al 10% e incubarlo per 24-48 ore a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, trasferire le cassette istologiche al 70% di etanolo e incorporare il tessuto in paraffina. Dopo l'incorporazione, posizionare le cassette istologiche sul ghiaccio per almeno un'ora. Quindi, tagliare sezioni orizzontali spesse cinque micron usando un microtomo.Trasferire le sezioni di tessuto a bagnomaria riscaldata fino a 45 gradi Celsius e posizionare le sezioni su vetrini carichi. Lasciare asciugare i vetrini su una griglia durante la notte a temperatura ambiente. Le immagini di ematossilina ed eosina di campioni di intestino tenue hanno mostrato un epitelio intestinale omeostatico all'ora zero, seguito dalla perdita di cellule all'interno dei compartimenti della cripta durante la fase apoptotica.Questo è stato seguito dalla fase rigenerativa in cui cellule altamente proliferative popolavano le cripte, portando alla fase di normalizzazione entro il settimo giorno. Il tracciamento del lignaggio da parte dell'EYFP ha mostrato che durante l'omeostasi, le cellule provenienti da cellule staminali di riserva positive al Bmi1 erano limitate alle posizioni da quattro a più sei all'interno delle cripte. La colorazione di EdU e Ki-67 ha mostrato una normale omeostasi intestinale nei topi irradiati fittizi, che si estende dalle cellule staminali attive attraverso la zona di amplificazione del transito.Durante la fase apoptotica, il numero di cellule EYFP-positive è diminuito, accompagnato da una perdita di cellule proliferative causata da danni da radiazioni. Nella fase rigenerativa è stata osservata l'attivazione delle cellule staminali di riserva e la rapida proliferazione delle cellule Bmi1-positive. L'ulteriore proliferazione e migrazione ha ripristinato l'integrità dell'epitelio intestinale.La colorazione TUNEL ha mostrato che le cellule apoptotiche sono assenti durante l'omeostasi. Un aumento della colorazione TUNEL è stato osservato verso la fine della fase apoptotica. Durante la fase rigenerativa, la colorazione TUNEL è diminuita costantemente all'interno delle cripte rigeneranti ed è stata quasi assente quando le cripte si sono normalizzate.Questa tecnica può essere combinata con il sequenziamento dell'RNA, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o l'analisi proteomica per raccogliere conoscenze più approfondite sul ruolo di specifiche linee cellulari durante la rigenerazione intestinale dopo la lesione. I ricercatori possono studiare le interazioni tra microbiota e popolazioni di cellule epiteliali, stromale e immunitarie nella rigenerazione intestinale per espandere la comprensione della capacità rigenerativa dell'epitelio intestinale.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenesi corticale: Transizione dai progressi nel laboratorio di terapie basate sulle cellule

Ricerca

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Un sistema per la coltura cellule epiteliali del pigmento Iris a studio Rigenerazione Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...