Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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저자는 조직 표본 준비에 대한 전문가의 도움을 받은 Stony Brook Cancer Center Histology Research Core와 동물 관리 및 취급에 대한 지원을 제공한 Stony Brook University의 실험실 동물 자원 부서에 감사를 표하고자 합니다. 이 연구는 Agnieszka B. Bialkowska와 Vincent W. Yang 박사에게 수여된 DK052230에 수여된 국립 보건원 DK124342의 보조금으로 지원되었습니다.

모든 마우스는 스토니 브룩 대학 (Stony Brook University)의 실험실 동물 자원 부서 (DLAR)에 수용되었습니다. Stony Brook University IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)는 동물 피험자와 관련된 모든 연구와 절차를 승인했습니다. 동물 피험자를 대상으로 한 실험은 승인된 동물 취급 프로토콜(IACUC #245094)에 따라 엄격하게 수행되었습니다.
참고: 마우스 균주 B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J(Bmi1-Cre...

이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 이를 통해 손상 후 7일 동안 장 상피의 변화를 정확하게 분석할 수 있습니다. 중요하게도, 선택된 시점은 손상의 중요한 단계를 반영하며 장의 뚜렷한 변화(손상, 세포자멸사, 재생 및 정상화 단계)를 특징으로 합니다60. 이 방사선 조사 모델은 확립되고 신중하게 평가되어 방사선 요법을 받는 환자가 경험하는...

인간의 장 상피는 완전히 평평하게 놓으면 배드민턴 코트의 절반 표면을 덮을 것입니다1. 대신, 인간의 내장 내용물을 분리하는 이 단일 세포층은 일련의 손가락 모양의 돌기, 융모 및 움푹 들어간 곳, 장의 표면적을 최대화하는 선와로 압축됩니다. 상피의 세포는 crypt-villus 축을 따라 분화합니다. 융모는 주로 영양소를 흡수하는 장세포, 점액을 분비하는 잔 세포, 호르몬을 생성하는 장내분비 세포로 구성되며, 선와(crypt)는 주로 디펜신 생성 파네스 세포, 활성 및 예비 줄기 세포, 전구 세포 2,3,4,5로 구성됩니다. 또한, 이들 세포가 밑에 있는 중간엽 구획의 기질 및 면역 세포 및 내강의 미생물군과 갖는 양방향 통신은 장 항상성을 유지하고 손상 후 회복에 중요한 복잡한 상호 작용 네트워크를 생성합니다 6,7,8.
장 상피는 인체에서 가장 빠르게자가 재생되는 조직이며 회전율은 2-6 일 9,10,11입니다. 항상성 동안, 류신이 풍부한 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5(LGR5)의 발현으로 특징지어지는 장 선와(orbit base columnar cells)의 기저부에 있는 활성 줄기 세포는 빠르게 분열하여 다른 모든 장 상피 계통으로 분화하는 전구 세포를 제공합니다. 그러나, 이들의 높은 유사분열 속도 때문에, 활성 줄기 세포 및 이들의 직계 전구체는 감마선 손상에 특히 민감하며, 방사선 조사후 세포자멸사를 겪는다 5,12,13,14. 소실되면 장내 선와(異聓) 내의 예비 줄기세포와 비줄기세포(전구체 및 일부 말기 분화된 세포의 소집단)가 활성화되어 기저음와구획(basal crypt compartment)을 보충하여 융모의 세포군을 재구성하여 장 상피(intestinal epithelium)를 재생시킨다15. 혈통 추적 기술을 사용하여 여러 연구 그룹은 예비 (정지) 줄기 세포가 활성 줄기 세포 13,16,17,18,19,20,21,22의 손실시 재생을 지원할 수 있음을 입증했습니다. 이 세포는 폴리콤 복합 단백질 1 종양 유전자(Bmi1), 마우스 텔로머라제 역전사 효소 유전자(mTert), 홉 호메오박스(Hopx) 및 류신이 풍부한 반복 단백질 1 유전자(Lrig1)의 존재를 특징으로 합니다. 또한, 비 줄기 세포는 손상 23,24,25,26,27,28,29,30,31시 장 선와를 보충 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 특히, 분비 세포 및 장 세포의 전구 세포는 손상시 탈분화를 겪고, 줄기 유사 세포로 되돌아 가며, 장 상피의 재생을 지원하는 것으로 나타났다. 최근 연구에서는 손상 시 줄기와 유사한 특성을 획득할 수 있는 능력을 가진 여러 마커(예: DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)를 발현하는 세포를 확인했습니다.32,33,34,35,36. 놀랍게도, Yu et al. 성숙한 파네스 세포(LYZ+)도 장 재생에 기여할 수 있음을 보여주었다37. 또한, 방사선 조사는 장 상피 세포의 세포 사멸을 유발하고 상피 장벽 기능을 방해하는 것 외에도 장내 세균총의 dysbiosis, 면역 세포 활성화 및 전 염증 반응의 시작, 중간 엽 및 기질 세포의 활성화를 초래합니다38,39.
감마선은 암 치료, 특히 결장직장 종양의 경우 귀중한 치료 도구이다40. 그러나 방사선 조사는 세포 손상을 유도하여 장 항상성에 큰 영향을 미치고, 이는 세포 사멸을 유발합니다. 방사선 노출은 환자의 회복을 늦추는 다중 섭동을 유발하며 급성기의 점막 손상 및 염증과 장기간의 설사, 요실금, 출혈 및 복통으로 표시됩니다. 이러한 증상의 파노라마를 위장 방사선 독성이라고 합니다. 또한, 경벽 섬유증 및/또는 혈관 경화증의 방사선 유발 진행은 치료 후 몇 년 후에 나타날 수 있습니다38,41. 손상 자체와 동시에, 방사선은 재생을 시작하고 조율하는 신호 전달 경로를 활성화하는 장 세포에서 복구 반응을 유도합니다42. 방사선 유발 소장 질환은 다른 장기 (예 : 자궁 경부, 전립선, 췌장, 직장)에 제공되는 골반 또는 복부 방사선 요법으로 인해 발생할 수 있습니다 41,43,44,45,46. 따라서 장 방사선 조사 손상은 중요한 임상적 문제이며 결과적인 병태생리학에 대한 더 나은 이해는 방사선 요법과 관련된 위장 합병증을 완화하기 위한 중재의 개발을 진전시킬 가능성이 있습니다. 방사선 외에 장 상피의 재생 목적을 조사할 수 있는 다른 기술이 있습니다. 염증 및 그 후의 재생을 연구하기 위한 형질전환 및 화학적 쥐 모델이 개발되었다47. 덱스트란 황산나트륨(DSS)은 장에서 염증을 유발하고 염증성 장 질환과 유사한 특성을 발달시킨다48. DSS 치료와 발암 성 화합물 인 아족시 메탄 (AOM)의 조합은 대장염 관련 암의 발병을 초래할 수 있습니다48,49. 허혈 재관류 유발 손상은 장 상피의 재생 가능성을 연구하는 데 사용되는 또 다른 방법입니다. 이 기술은 경험과 외과 지식이 필요합니다50. 또한, 앞서 언급 한 기술은 방사선과 다른 유형의 부상을 유발하고 다른 재생 메커니즘의 개입으로 이어질 수 있습니다. 또한 이러한 모델은 시간이 많이 걸리고 방사선 기술은 상당히 간단합니다. 최근, 장 재생의 기전을 연구하기 위해 장과 결장에서 생성된 엔테로이드와 콜로노이드를 방사선 손상과 병용하여 사용하는 시험관 내 방법이 사용되고 있다51,52. 그러나 이러한 기술은 그들이 모델링하는 기관을 완전히 요약하지 않습니다53,54.
제시된 프로토콜에는 타목시펜 치료 후 예비 줄기 세포 집단(Bmi1-CreER; Rosa26eYFP입니다. 이 모델은 12 Gy 전신 방사선 조사를 이용하는데, 이는 예비 줄기 세포를 활성화시키기에 충분히 상당한 장 손상을 유도하는 동시에 손상 후 7일 이내에 장 재생 능력의 후속 조사를 허용한다55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

장 상피는 단일 층의 세포로 구성되어 있지만 장 선와(intestinal crypt)의 바닥에 위치한 장 줄기 세포의 활성 증식에 의해 생성되는 여러 유형의 말기 분화 세포를 포함합니다. 그러나 급성 장 손상이 발생하는 동안 이러한 활성 장 줄기 세포는 세포 사멸을 겪습니다. 감마선 조사는 널리 사용되는 대장암 치료제로, 치료적으로는 효과적이지만 활성 줄기 세포 풀을 고갈시키는 부작용이 있습니다. 실제로 환자들은 방사선 치료를 받는 동안 부분적으로 활성 줄기 세포 고갈로 인해 위장 방사선 증후군을 자주 경험합니다. 장 선와에서 활성 장 줄기 세포의 손실은 일반적으로 정지 상태의 예비 장 줄기 세포 풀을 활성화하고 분비 및 장 세포 전구체 세포의 탈분화를 유도합니다. 이러한 세포가 아니라면 장 상피는 방사선 요법 및 기타 주요 조직 손상으로부터 회복하는 능력이 부족할 것입니다. 계통 추적 기술의 새로운 발전은 재생 중 세포의 활성화, 분화 및 이동을 추적할 수 있게 해주며, 장에서 이를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구는 방사선 손상 후 마우스 장 상피 내 세포를 분석하는 방법을 제시하는 것을 목적으로 한다.

쥐의 유전적 혈통 추적과 함께 12Gy 전신 방사선 조사(TBI)를 사용하면 장내 방사선 손상의 결과를 철저히 분석할 수 있습니다. 시작하려면 Bmi1-CreER; Rosa26eYFP 마우스는 Bmi1+ 예비 줄기 세포 집단 내에서 향상된 황색 형광 단백질(EYFP) 발현을 유도하는 단일 타목시펜 주사를 받았습니다. 타목시펜 주사 이틀 후, 마우스는 방사선 조사 또는 가짜 방사선 조사를 받았다. 안?...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

위장관은 방사선 치료 암 치료 시 손상에 가장 민감한 기관 중 하나입니다. 그것은 동시에 그러한 모욕에 이어 가장 높은 재생 능력 중 하나를 가진 장기 시스템입니다. 제시된 프로토콜은 장 상피의 재생 능력을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.

이온화 조사에 대한 반응으로 장 상피 재생

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

감마선 조사는 대장암에 널리 사용되는 치료법입니다. 그리고 치료적으로 효과적이지만 위장관에 부정적인 영향을 미칩니다. 제시된 프로토콜은 방사선 손상 후 재생 동안 세포의 활성화, 분화 및 이동을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 중요한 것은 이 모델을 통해 손상 후 장 세포의 운명을 추적할 수 있으므로 특정 세포 하위 집단의 재생 능력에 대한 더 나은 이해를 제공할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 뚜렷한 혈통 추적 동물 모델을 사용하여 손상 후 세포의 다양한 하위 집단의 실시간 행동과 상호 작용을 연구할 수 있습니다.이 프로토콜에 대한 약간의 수정은 방사선 손상 시 미생물군과 다른 상피, 기질 및 면역 세포 집단 사이의 관계를 조사할 수 있도록 해야 합니다. 시작하려면 멸균 옥수수 기름에 타목시펜 분말을 마이크로 리터당 30 마이크로 그램의 농도로 재현 탁하십시오. 60 % 진폭으로 30 초 온-오프 사이클에서 3 분 동안 초음파 처리하십시오.실온에서 1시간 동안 어둠 속에서 회전시켜 혼합한다. 그런 다음 EdU 분말에 멸균 DMSO를 첨가하여 EdU를 준비합니다. 총 부피의 1/5을 더하고 멸균 초순수의 나머지 부피를 천천히 첨가하십시오.완전히 용해되면 분취하여 섭씨 20도에서 보관하십시오. 물 70% 에탄올, 섭씨 4도로 냉각된 DPBS, Bouin의 고정 완충액, 10% 완충 포르말린과 같은 조직 수집 및 고정용 시약을 준비합니다. 다음으로, 마우스 해부 키트, 페트리 접시, 10 밀리리터 주사기에 부착 된 16 게이지 위 관법 바늘 및 조직 학적 카세트와 같은 필요한 장비를 준비하십시오.감마선 방사선 조사 노출 이틀 전에, 타목시펜 주사를 위해 실험동물을 준비한다. 각 동물의 무게를 측정하고 필요한 복용량을 계산하십시오. 복부를 70 % 에탄올로 소독하십시오.그런 다음 1밀리리터 주사기에 부착된 27게이지 바늘을 사용하여 단일 용량의 타목시펜을 복강 내 투여하여 Cre 매개 재조합을 유도합니다. 잠재적인 타목시펜 독성을 배제하기 위해 다음 48시간 동안 동물을 관찰합니다. 48 시간 후, 동물을 방사선 조사실로 옮깁니다.감마선 조사기의 샘플 챔버를 70% 에탄올 용액으로 소독합니다. 흡수 매트와 동물을 샘플 챔버 내부에 놓습니다. 뚜껑을 덮고 챔버를 닫습니다.감마선 조사기를 프로그래밍하여 동물을 12개의 회색 전신 조사에 노출시킵니다. 그런 다음 키를 시작 위치로 돌리고 시작을 눌러 노출을 시작합니다. 활성 노출 시간 동안 방을 나가십시오.미리 설정된 시간이 경과하면 기기가 자동으로 멈추고 신호음이 울리기 시작합니다. 키를 정지 위치로 돌려 기계를 끕니다. 샘플 챔버를 열고 뚜껑을 제거합니다.동물을 케이지로 옮기고 샘플 챔버를 70% 에탄올로 소독합니다. 동물을 기존의 주거실로 다시 옮기고 치료 후 상태를 관찰합니다. 매일 동물의 체중을 모니터링하십시오.계획된 안락사 3시간 전에 복부를 소독하고 28게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 EdU 원액을 마우스에 복강 주사합니다. 동물을 안락사시킨 후, 방사선 조사 후 다른 시점에서 근위 내장을 수집하십시오. 소장의 근위 부분을 해부하고 부착 된 조직을 제거하십시오.10밀리리터 주사기에 부착된 16게이지 직선 공급 바늘을 사용하여 차가운 DPBS로 조직을 세척하고 Bouin의 고정 완충액으로 조직을 고정합니다. 창자를 세로로 자르고 Swiss-roll 기술을 사용하여 근위 장을 굴립니다. 조직을 10% 완충된 포르말린이 있는 용기에 있는 조직학적 카세트에 넣고 실온에서 24-48시간 동안 배양합니다.배양 후 조직학적 카세트를 70% 에탄올로 옮기고 조직을 파라핀에 삽입합니다. 포매 후 조직학적 카세트를 얼음 위에 최소 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 마이크로톰을 사용하여 5미크론 두께의 수평 단면을 자릅니다.조직 절편을 섭씨 45도까지 예열 된 수조로 옮기고 절편을 충전 된 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 실온에서 밤새 랙에 두어 건조시킵니다. 소장 표본의 헤마톡실린 및 에오신 이미지는 0시간에 항상성 장 상피를 보여주었고, 그 후 세포자멸사 단계 동안 지하실 구획 내의 세포가 손실되었습니다.그 다음에는 증식성이 높은 세포가 선와를 채우는 재생 단계가 이어졌고, 7일째까지 정상화 단계로 이어졌습니다. EYFP에 의한 계통 추적은 항상성 동안 Bmi1 양성 예비 줄기 세포에서 유래 한 세포가 선와 내에서 플러스 4에서 플러스 6 위치로 제한되었음을 보여주었습니다. EdU 및 Ki-67 염색은 가짜 방사선 조사 마우스에서 정상적인 장 항상성을 보여주었으며, 활성 줄기 세포에서 통과 증폭 영역을 통해 확장되었습니다.세포 사멸 단계에서 EYFP 양성 세포의 수가 감소하고 방사선 손상으로 인한 증식 세포의 손실이 동반되었습니다. 재생 단계에서는 예비 줄기 세포의 활성화와 Bmi1 양성 세포의 빠른 증식이 관찰되었습니다. 추가 증식과 이동은 장 상피 무결성을 회복했습니다.TUNEL 염색은 항상성 동안 세포사멸 세포가 존재하지 않는다는 것을 보여주었다. TUNEL 염색의 증가는 세포사멸 단계 후반에 관찰되었다. 재생 단계에서 TUNEL 염색은 재생 크립트 내에서 꾸준히 감소했으며 크립트가 정상화되었을 때 거의 없었습니다.이 기술은 RNA 염기서열 분석, 단일 세포 RNA 염기서열 분석, 형광 활성화 세포 분류 또는 단백질체 분석과 결합하여 손상 후 장 재생 중 특정 세포 계통의 역할에 대한 보다 심층적인 지식을 수집할 수 있습니다. 연구자들은 장 재생에서 미생물군과 상피, 기질 및 면역 세포 집단 간의 상호 작용을 조사하여 장 상피의 재생 능력에 대한 이해를 넓힐 수 있습니다.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

피질 Neurogenesis : 세포 기반 치료하기 위해 연구소의 발전에서 전환

연구

생물학

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

히드라의 글루타티온 유도 먹이 반응을 측정

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 접근 장 상피 세포 침투성을 결정 하

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.