Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne Stony Brook Cancer Center Histology Research Core for eksperthjelp med vevsprøvepreparering og Divisjon for laboratoriedyrressurser ved Stony Brook University for hjelp med dyrepleie og håndtering. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health DK124342 tildelt Agnieszka B. Bialkowska og DK052230 til Dr. Vincent W. Yang.

Alle musene ble plassert i Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) ved Stony Brook University. Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkjente alle studier og prosedyrer som involverte dyreforsøk. Eksperimenter som involverte dyr ble utført strengt i samsvar med den godkjente dyrehåndteringsprotokollen (IACUC #245094).
MERK: Musestammer B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) og B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Ros...

Denne protokollen beskriver en robust og reproduserbar stråleskademodell. Det muliggjør presis analyse av endringene i tarmepitelet i løpet av 7 dager etter skaden. Det er viktig at de valgte tidspunktene gjenspeiler viktige stadier av skade og er preget av tydelige endringer i tarmen (skade-, apoptose-, regenererings- og normaliseringsfaser)60. Denne bestrålingsmodellen er etablert og nøye vurdert, og demonstrerer en egnet manifestasjon av skade for å etterligne den som oppleves av pasiente...

Det menneskelige tarmepitelet ville dekke omtrent overflaten av en halv badmintonbane hvis det ble plassert helt flatt1. I stedet komprimeres dette enkeltcellelaget som skiller mennesker fra innholdet i tarmen til en serie fingerlignende fremspring, villi og innrykk, krypter som maksimerer tarmens overflateareal. Cellene i epitelet skiller seg langs en krypt-villus-akse. Villus består primært av næringsabsorberende enterocytter, slimutskillende begerceller og de hormonproduserende enteroendokrine cellene, mens kryptene primært består av defensinproduserende Paneth-celler, aktive og reservestamceller og stamceller 2,3,4,5. Videre genererer den toveis kommunikasjonen disse cellene har med stromale og immunceller i det underliggende mesenkymale rommet og mikrobiota av lumen et komplekst nettverk av interaksjoner som opprettholder tarmhomeostase og er kritisk for utvinning etter skade 6,7,8.
Tarmepitelet er det raskest selvfornyende vevet i menneskekroppen, med en omsetningshastighet på 2-6 dager 9,10,11. Under homeostase deler aktive stamceller ved basen av tarmkrypter (kryptbasesøyleceller), preget av ekspresjonen av leucinrik repetisjonsholdig G-proteinkoblet reseptor 5 (LGR5), raskt og gir stamceller som differensierer i alle andre tarmepitellinjer. På grunn av deres høye mitotiske hastighet er imidlertid aktive stamceller og deres umiddelbare forfedre spesielt følsomme for gammastrålingsskade og gjennomgår apoptose etter bestråling 5,12,13,14. Ved tapet gjennomgår reservestamceller og ikke-stamceller (subpopulasjon av forfedre og noen terminalt differensierte celler) i tarmkrypter aktivering og fyller opp det basale kryptrommet, som deretter kan rekonstituere cellepopulasjoner av villi og dermed regenerere tarmepitelet15. Ved hjelp av avstamningssporingsteknikker har flere forskningsgrupper vist at reservestamceller (hvilende) er i stand til å støtte regenerering ved tap av aktive stamceller 13,16,17,18,19,20,21,22. Disse cellene er karakterisert ved tilstedeværelsen av polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), mus telomerase revers transkriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx) og leucinrikt repetisjonsprotein 1 gen (Lrig1). I tillegg har det vist seg at ikke-stamceller er i stand til å fylle tarmkrypter ved skade 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Spesielt har det vist seg at forfedre til sekretoriske celler og enterocytter gjennomgår dedifferensiering ved skade, går tilbake til stamlignende celler og støtter regenerering av tarmepitelet. Nylige studier har identifisert celler som uttrykker flere markører som har kapasitet til å skaffe seg stammelignende egenskaper ved skade (for eksempel DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 +) 32,33,34,35,36. Overraskende nok viste Yu et al. at selv modne Paneth-celler (LYZ +) kan bidra til intestinal regenerering37. Videre, i tillegg til å forårsake apoptose av tarmepitelceller og forstyrre epitelbarrierefunksjonen, resulterer bestråling i dysbiose av tarmfloraen, immuncelleaktivering og initiering av en proinflammatorisk respons, og aktivering av mesenkymale og stromale celler38,39.
Gammastråling er et verdifullt terapeutisk verktøy i kreftbehandling, spesielt så for kolorektal svulster40. Imidlertid påvirker bestråling signifikant intestinal homeostase ved å indusere skade på cellene, noe som fører til apoptose. Strålingseksponering forårsaker flere forstyrrelser som reduserer pasientens utvinning og er preget av slimhinneskade og betennelse i den akutte fasen og diaré, inkontinens, blødning og magesmerter på lang sikt. Denne panoply av manifestasjoner er referert til som gastrointestinal stråling toksisitet. I tillegg kan stråleindusert progresjon av transmural fibrose og / eller vaskulær sklerose bare manifestere år etter behandlingen 38,41. Samtidig med selve skaden induserer stråling en reparasjonsrespons i tarmceller som aktiverer signalveier som er ansvarlige for å initiere og orkestrere regenerering42. Stråleindusert tarmsykdom kan stamme fra strålebehandling av bekken eller buk gitt til andre organer (som livmorhals, prostata, bukspyttkjertel, endetarm)41,43,44,45,46. Tarmbestrålingsskade er dermed et betydelig klinisk problem, og en bedre forståelse av den resulterende patofysiologien vil sannsynligvis fremme utviklingen av tiltak for å lindre gastrointestinale komplikasjoner forbundet med strålebehandling. Det finnes andre teknikker som gjør det mulig å undersøke det regenerative formålet med tarmepitelet bortsett fra stråling. Transgene og kjemiske murinmodeller for å studere inflammasjon og regenerering deretter er utviklet47. Dextran natriumsulfat (DSS) induserer betennelse i tarmen og fører til utvikling av egenskaper som ligner på inflammatorisk tarmsykdom48. En kombinasjon av DSS-behandling med den kreftfremkallende forbindelsen azoksymetan (AOM) kan resultere i utvikling av kolittassosiert kreft48,49. Iskemi reperfusjonsindusert skade er en annen metode som brukes til å studere det regenerative potensialet i tarmepitelet. Denne teknikken krever erfaring og kirurgisk kunnskap50. Videre forårsaker de nevnte teknikkene forskjellige typer skader enn stråling og kan føre til involvering av forskjellige regenereringsmekanismer. I tillegg er disse modellene tidkrevende, mens strålingsteknikken er ganske kort. Nylig har in vitro-metoder som benytter enteroider og kolonoider generert fra tarm og tykktarm blitt brukt i kombinasjon med strålingsskade for å studere mekanismene for intestinal regenerering51,52. Disse teknikkene rekapitulerer imidlertid ikke fullt ut orgelet de modellerer53,54.
Protokollen som presenteres inkluderer beskrivelsen av en murinmodell for gammastrålingsskade i kombinasjon med en genetisk modell som etter tamoksifenbehandling tillater sporing av linjer som stammer fra reservestamcellepopulasjonen (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Denne modellen benytter en 12 Gy helkroppsbestråling, som induserer betydelig nok tarmskade til å aktivere reservestamceller, samtidig som den tillater den påfølgende undersøkelsen av intestinal regenerativ evne innen 7 dager etter skade55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

Tarmepitelet består av et enkelt lag av celler, men inneholder likevel flere typer terminalt differensierte celler, som genereres ved aktiv spredning av intestinale stamceller som ligger i bunnen av tarmkryptene. Under hendelser med akutt tarmskade gjennomgår imidlertid disse aktive intestinale stamcellene celledød. Gammabestråling er en mye brukt kolorektal kreftbehandling, som, selv om den er terapeutisk effektiv, har bivirkningen av å tømme det aktive stamcellebassenget. Faktisk opplever pasienter ofte gastrointestinalt strålingssyndrom mens de gjennomgår strålebehandling, delvis på grunn av aktiv stamcelleuttømming. Tapet av aktive intestinale stamceller i tarmkrypter aktiverer et basseng av typisk hvilende reserve intestinale stamceller og induserer dedifferensiering av sekretoriske og enterocyttforløperceller. Hvis ikke for disse cellene, ville tarmepitelet mangle evnen til å gjenopprette fra strålebehandling og andre slike store vevsfornærmelser. Nye fremskritt innen avstamningssporingsteknologier tillater sporing av aktivering, differensiering og migrasjon av celler under regenerering og har blitt brukt til å studere dette i tarmen. Denne studien tar sikte på å skildre en metode for analyse av celler i musens tarmepitel etter strålingsskade.

Bruk av 12 Gy helkroppsbestråling (TBI) i kombinasjon med genetisk avstamningssporing muliggjør en grundig analyse av konsekvenser av stråleskade i tarmen. For å starte, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus mottok en enkelt tamoxifen-injeksjon, som induserer forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) -uttrykk i en Bmi1 + reserve stamcellepopulasjon. To dager etter tamoxifen-injeksjonen gjennomgikk musene bestråling eller skambestråling. Tre timer før avlivning ble musene injisert ...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Mage-tarmkanalen er et av de mest følsomme organene for skade ved radioterapeutisk kreftbehandling. Det er samtidig et organsystem med en av de høyeste regenerative kapasitetene etter slike fornærmelser. Den presenterte protokollen beskriver en effektiv metode for å studere regenerativ kapasitet i tarmepitelet.

Intestinal epitelial regenerering som respons på ioniserende bestråling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gamma bestråling er en mye brukt behandling for kolorektal kreft. Og mens det er terapeutisk effektivt, har det negative effekter på mage-tarmkanalen. Den presenterte protokollen beskriver en effektiv metode for å studere aktivering, differensiering og migrasjon av celler under regenerering etter strålingsskade.Denne protokollen beskriver en robust og reproduserbar stråleskademodell. Det er viktig at denne modellen gjør det mulig å spore tarmcelleskjebnen etter skade og gir dermed bedre forståelse av regenerativ kapasitet til spesifikk cellepopulasjon. Denne teknikken kan benytte forskjellige avstamningssporende dyremodeller for å studere sanntidsadferd og samspillet mellom ulike underpopulasjoner av celler etter skade.Mindre modifikasjoner i denne protokollen bør tillate undersøkelse av forholdet mellom mikrobiota og forskjellige epitel-, stromal- og immuncellepopulasjoner ved stråleskade. For å begynne, resuspendere tamoxifenpulver i steril maisolje i en konsentrasjon på 30 mikrogram per mikroliter. Sonikere i tre minutter i 30 sekunder on-off sykluser med 60% amplitude.Bland ved rotasjon i mørket i en time ved romtemperatur. Forbered deretter EdU ved å tilsette sterilt DMSO til EdU-pulver. Tilsett 1/5 av totalvolumet, og tilsett sakte det gjenværende volumet av sterilt ultrarent vann.Når det er helt oppløst, aliquot og lagre ved 20 grader Celsius. Forbered reagenser for vevsinnsamling og fiksering, for eksempel 70% etanol i vann, DPBS kjølt til fire grader Celsius, Bouins fiksative buffer og 10% bufret formalin. Forbered deretter nødvendig utstyr, for eksempel et musdisseksjonssett, petriskåler, en 16-gauge gavage nål festet til en 10 milliliter sprøyte og histologiske kassetter.To dager før gammabestrålingseksponering, klargjør forsøksdyrene for tamoxifeninjeksjon. Vei hvert dyr, og beregne den nødvendige doseringen. Desinfiser bukområdet med 70% etanol.Deretter administreres en enkelt dose tamoxifen intraperitonealt ved hjelp av en 27-gauge nål festet til en en-milliliter sprøyte for å indusere Cre-mediert rekombinasjon. Observer dyr i de neste 48 timene for å utelukke potensiell tamoksifentoksisitet. Etter 48 timer, overfør dyrene til bestrålingsrommet.Desinfiser prøvekammeret i gamma-bestråleren med 70% etanoloppløsning. Plasser den absorberende matten og dyrene inne i prøvekammeret. Plasser lokket, og lukk kammeret.Programmer gammabestråleren til å utsette dyr for 12 grå helkroppsbestråling. Vri deretter nøkkelen til startposisjonen, og trykk på start for å starte eksponeringen. Forlat rommet for aktiv eksponeringstid.Etter at den forhåndsinnstilte tiden er gått, stopper maskinen automatisk og begynner å pipe. Slå av maskinen ved å vri nøkkelen i stoppposisjon. Åpne prøvekammeret, og ta av lokket.Overfør dyrene til buret, og desinfiser prøvekammeret med 70% etanol. Overfør dyrene tilbake til det konvensjonelle boligrommet, og observer tilstanden deres etter behandling. Overvåk dyrets vekt hver dag.Tre timer før den planlagte eutanasien, desinfiser mageområdet og injiser musene intraperitonealt med 100 mikroliter EdU-oppløsning ved hjelp av en 28-gauge insulinsprøyte. Etter å ha avlivet dyret, samle de proksimale tarmene på forskjellige tidspunkter etter bestråling. Dissekere den proksimale delen av tynntarmen, og fjern vedlagte vev.Skyll vevet med kalde DPBS ved hjelp av en 16-gauge rett fôringsnål festet til en 10-milliliter sprøyte, og fest vevet med Bouins fiksative buffer. Klipp tarmene åpne i lengderetningen, og rull de proksimale tarmene ved hjelp av Swiss-roll-teknikken. Plasser vevet i en histologisk kassett i en beholder med 10% bufret formalin, og inkuber det i 24 til 48 timer ved romtemperatur.Etter inkubering, overfør de histologiske kassettene til 70% etanol, og legg vevet i paraffin. Etter innebygging, legg de histologiske kassettene på is i minst en time. Deretter kutter du fem mikron tykke horisontale seksjoner ved hjelp av en mikrotom.Overfør vevsseksjonene til et vannbad oppvarmet opp til 45 grader Celsius, og plasser seksjonene på ladede lysbilder. La lysbildene stå på et stativ over natten ved romtemperatur for å tørke. Hematoksylin- og eosinbilder av tynntarmsprøver viste et homeostatisk tarmepitel ved null time, etterfulgt av tap av celler i kryptrom i den apoptotiske fasen.Dette ble etterfulgt av den regenerative fasen der svært proliferative celler befolket kryptene, noe som førte til normaliseringsfasen etter dag syv. Avstamningssporing av EYFP viste at under homeostase var cellene som stammer fra Bmi1 positive reservestamceller begrenset til pluss fire til pluss seks posisjoner i krypter. EdU- og Ki-67-farging viste normal intestinal homeostase hos sham bestrålte mus, som strakte seg fra aktive stamceller gjennom transittforsterkende sone.Under den apoptotiske fasen ble antallet EYFP-positive celler redusert, ledsaget av tap av proliferative celler forårsaket av strålingsskader. I regenerativ fase ble det observert aktivering av reservestamceller og rask proliferasjon av Bmi1-positive celler. Videre spredning og migrasjon gjenopprettet integriteten til tarmepitelet.TUNEL-farging viste at apoptotiske celler er fraværende under homeostase. En økning i TUNEL-farging ble observert sent i den apoptotiske fasen. Under den regenerative fasen ble TUNEL-fargingen stadig redusert i de regenererende kryptene og var nesten fraværende da kryptene normaliserte seg.Denne teknikken kan kombineres med RNA-sekvensering, enkeltcelle RNA-sekvensering, fluorescensaktivert cellesortering eller proteomisk analyse for å skaffe mer inngående kunnskap om rollen til spesifikke cellelinjer under intestinal regenerering etter skade. Forskerne kan undersøke samspillet mellom mikrobiota og epitel-, stromal- og immuncellepopulasjoner i tarmregenerering for å utvide forståelsen av tarmepitelets regenerative evne.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling glutation-indusert Fôring Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...