Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Авторы выражают благодарность Центру исследований гистологии Онкологического центра Стоуни-Брук за экспертную помощь в подготовке образцов тканей и Отделу ресурсов лабораторных животных Университета Стоуни-Брук за помощь в уходе за животными и обращении с ними. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DK124342, присужденными Агнешке Б. Бялковской, и DK052230 доктору Винсенту В. Янгу.

Все мыши были размещены в Отделе лабораторных ресурсов животных (DLAR) в Университете Стоуни-Брук. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Стоуни-Брук одобрил все исследования и процедуры с участием животных. Эксперименты с участием животных ...

Этот протокол описывает надежную и воспроизводимую модель лучевого поражения. Это позволяет проводить точный анализ изменений в кишечном эпителии в течение 7 дней после травмы. Важно отметить, что выбранные временные точки отражают критические стадии повреждения и характеризуются от...

Кишечный эпителий человека покрывал бы примерно половину площадки для бадминтона, если бы он былполностью плоским1. Вместо этого этот одноклеточный слой, отделяющий людей от содержимого их кишечника, уплотняется в серию пальцевидных выступов, ворсинок и углублений, крипт, которые максимизируют площадь поверхности кишечника. Клетки эпителия дифференцируются по оси крипты-ворсинки. Ворсинки в основном состоят из поглощающих питательные вещества энтероцитов, бокаловидных клеток, секретирующих слизь, и гормонопродуцирующих энтероэндокринных клеток, в то время как крипта в основном состоит из дефензин-продуцирующих клеток Панета, активных и резервных стволовых клеток и клеток-предшественников 2,3,4,5. Кроме того, двунаправленная связь этих клеток со стромальными и иммунными клетками нижележащего мезенхимального компартмента и микробиотой просвета создает сложную сеть взаимодействий, которая поддерживает гомеостаз кишечника и имеет решающее значение для восстановления после травмы 6,7,8.
Кишечный эпителий является наиболее быстро самообновляющейся тканью в организме человека, со скоростью обновления 2-6 дней 9,10,11. Во время гомеостаза активные стволовые клетки у основания кишечных крипт (столбчатые клетки крипты), отмеченные экспрессией богатого лейцином повторного рецептора, связанного с G-белком (LGR5), быстро делятся и обеспечивают клетки-предшественники, которые дифференцируются во все другие линии кишечного эпителия. Однако из-за высокой митотической скорости активные стволовые клетки и их непосредственные предшественники особенно чувствительны к поражению гамма-излучением и подвергаются апоптозу после облучения 5,12,13,14. При их потере резервные стволовые клетки и нестволовые клетки (субпопуляция предшественников и некоторых терминально дифференцированных клеток) в кишечных криптах подвергаются активации и пополняют базальный компартмент крипты, который затем может восстанавливать клеточные популяции ворсинок и, таким образом, регенерировать кишечный эпителий15. Используя методы отслеживания происхождения, несколько исследовательских групп продемонстрировали, что резервные (покоящиеся) стволовые клетки способны поддерживать регенерацию при потере активных стволовых клеток 13,16,17,18,19,20,21,22. Эти клетки характеризуются наличием онкогена 1-го белка поликомбного комплекса (Bmi1), гена обратной транскриптазы теломеразы мыши (mTert), гомеобокса хмеля (Hopx) и богатого лейцином гена повторного белка 1 (Lrig1). Кроме того, было показано, что нестволовые клетки способны пополнять кишечные крипты при повреждении 23,24,25,26,27,28,29,30,31. В частности, было показано, что предшественники секреторных клеток и энтероцитов подвергаются дедифференцировке при повреждении, возвращаются к стволовым клеткам и поддерживают регенерацию кишечного эпителия. Недавние исследования выявили клетки, экспрессирующие несколько маркеров, которые обладают способностью приобретать стволовые характеристики при травме (такие как DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Удивительно, но Yu et al. показали, что даже зрелые клетки Панета (LYZ+) могут способствовать регенерации кишечника37. Кроме того, помимо апоптоза эпителиальных клеток кишечника и нарушения функции эпителиального барьера, облучение приводит к дисбиозу кишечной флоры, активации иммунных клеток и инициации провоспалительного ответа, а также активации мезенхимальных и стромальных клеток38,39.
Гамма-излучение является ценным терапевтическим инструментом при лечении рака, особенно при колоректальных опухолях40. Однако облучение значительно влияет на гомеостаз кишечника, вызывая повреждение клеток, что приводит к апоптозу. Радиационное облучение вызывает множественные возмущения, которые замедляют выздоровление пациента и характеризуются повреждением слизистой оболочки и воспалением в острой фазе, а также диареей, недержанием мочи, кровотечением и болями в животе в течение длительного времени. Этот набор проявлений называется желудочно-кишечной радиационной токсичностью. Кроме того, радиационно-индуцированное прогрессирование трансмурального фиброза и/или склероза сосудов может проявиться только спустя годы после лечения38,41. Одновременно с самой травмой радиация вызывает реакцию восстановления в клетках кишечника, которая активирует сигнальные пути, ответственные за инициирование и организацию регенерации42. Радиационно-индуцированное заболевание тонкой кишки может возникать в результате лучевой терапии органов малого таза или брюшной полости, проводимых в других органах (таких как шейка матки, простата, поджелудочная железа, прямая кишка)41,43,44,45,46. Таким образом, поражение кишечника от облучения является серьезной клинической проблемой, и лучшее понимание патофизиологии, вероятно, будет способствовать разработке вмешательств для облегчения желудочно-кишечных осложнений, связанных с лучевой терапией. Существуют и другие методы, которые позволяют исследовать регенеративное назначение кишечного эпителия, помимо облучения. Были разработаны трансгенные и химические мышиные модели для изучения воспаления и последующей регенерации47. Декстран сульфат натрия (DSS) индуцирует воспаление в кишечнике и приводит к развитию характеристик, сходных с характеристиками воспалительного заболевания кишечника48. Комбинация лечения DSS проканцерогенным соединением азоксиметаном (ОСО) может привести к развитию рака, связанного с колитом48,49. Травма, вызванная ишемией, является еще одним методом, используемым для изучения регенеративного потенциала кишечного эпителия. Эта методика требует опыта и хирургических знаний50. Кроме того, вышеупомянутые методы вызывают различные виды повреждений, чем радиация, и могут привести к вовлечению различных механизмов регенерации. Кроме того, эти модели отнимают много времени, в то время как радиационная техника довольно короткая. В последнее время методы in vitro с использованием энтероидов и колоноидов, генерируемых из кишечника и толстой кишки, используются в сочетании с лучевым повреждением для изучения механизмов регенерации кишечника51,52. Однако эти методы не полностью повторяют орган, который они моделируют53,54.
Представленный протокол включает описание мышиной модели поражения гамма-излучением в сочетании с генетической моделью, которая после лечения тамоксифеном позволяет отслеживать линии, происходящие из резервной популяции стволовых клеток (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Эта модель использует облучение всего тела 12 Гр, которое вызывает достаточно значительное повреждение кишечника для активации резервных стволовых клеток, в то же время позволяя проводить последующее исследование регенеративной способности кишечника в течение 7 дней после травмы55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

Кишечный эпителий состоит из одного слоя клеток, но содержит несколько типов терминально дифференцированных клеток, которые образуются в результате активной пролиферации кишечных стволовых клеток, расположенных на дне кишечных крипт. Однако во время острого повреждения кишечника эти активные кишечные стволовые клетки подвергаются клеточной гибели. Гамма-облучение является широко используемым методом лечения колоректального рака, который, хотя и является терапевтически эффективным, имеет побочный эффект истощения активного пула стволовых клеток. Действительно, пациенты часто испытывают желудочно-кишечный лучевой синдром во время лучевой терапии, отчасти из-за активного истощения стволовых клеток. Потеря активных кишечных стволовых клеток в кишечных криптах активирует пул обычно спокойных резервных стволовых клеток кишечника и индуцирует дедифференцировку секреторных и энтероцитарных клеток-предшественников. Если бы не эти клетки, кишечный эпителий не смог бы восстановиться после лучевой терапии и других подобных серьезных повреждений тканей. Новые достижения в технологиях отслеживания линий позволяют отслеживать активацию, дифференцировку и миграцию клеток во время регенерации и успешно используются для изучения этого в кишечнике. Это исследование направлено на то, чтобы изобразить метод анализа клеток кишечного эпителия мыши после лучевого поражения.

Использование облучения всего тела (ЧМТ) 12 Гр в сочетании с отслеживанием генетического происхождения мышей позволяет провести тщательный анализ последствий лучевого поражения кишечника. Для начала, Bmi1-CreER; Мыши Rosa26eYFP получили однократную инъекцию тамоксифена, котора...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Желудочно-кишечный тракт является одним из наиболее чувствительных органов к травмам при радиотерапевтическом лечении рака. Это одновременно система органов с одной из самых высоких регенеративных способностей после таких инсультов. Представленный протокол описывает эффективный метод исследования регенеративной способности кишечного эпителия.

Регенерация эпителия кишечника в ответ на ионизирующее облучение

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Гамма-облучение является широко используемым методом лечения колоректального рака. И хотя он терапевтически эффективен, он оказывает негативное влияние на желудочно-кишечный тракт. Представленный протокол описывает эффективный метод изучения активации, дифференцировки и миграции клеток при регенерации после лучевого поражения.Этот протокол описывает надежную и воспроизводимую модель лучевого поражения. Важно отметить, что эта модель позволяет отслеживать судьбу клеток кишечника после травмы и, таким образом, обеспечивает лучшее понимание регенеративной способности конкретной клеточной субпопуляции. Этот метод может использовать различные модели животных, отслеживающие родословную, для изучения поведения в реальном времени и взаимодействия различных субпопуляций клеток после травмы.Незначительные изменения в этом протоколе должны позволить исследовать взаимосвязь между микробиотой и различными популяциями эпителиальных, стромальных и иммунных клеток при лучевом поражении. Для начала ресуспендируйте порошок тамоксифена в стерильном кукурузном масле в концентрации 30 мкг на микролитр. Ультразвук в течение трех минут в течение 30 секунд циклов включения-выключения с амплитудой 60%.Перемешайте вращением в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. Затем приготовьте EdU, добавив стерильный ДМСО в порошок EdU. Добавьте 1/5 от общего объема, а оставшийся объем медленно добавьте стерильную сверхчистую воду.При полном растворении аликвотировать и хранить при температуре 20 градусов Цельсия. Приготовьте реагенты для сбора и фиксации тканей, такие как 70% этанол в воде, DPBS, охлажденный до четырех градусов Цельсия, фиксирующий буфер Буэна и 10%-ный буферный формалин. Затем подготовьте необходимое оборудование, такое как набор для вскрытия мышей, чашки Петри, игла для зонда 16-го калибра, прикрепленная к 10-миллилитровому шприцу, и гистологические кассеты.За двое суток до облучения гамма-облучением подготовят подопытных животных к инъекции тамоксифена. Взвесьте каждое животное и рассчитайте необходимую дозировку. Продезинфицируйте область живота 70% этанолом.Затем введите однократную дозу тамоксифена внутрибрюшинно с помощью иглы 27-го калибра, прикрепленной к шприцу объемом один миллилитр, чтобы вызвать рекомбинацию, опосредованную Cre. Наблюдайте за животными в течение следующих 48 часов, чтобы исключить потенциальную токсичность тамоксифена. Через 48 часов переведите животных в комнату облучения.Продезинфицируйте камеру для образцов в гамма-облучателе 70%-ным раствором этанола. Поместите абсорбирующий коврик и животных в камеру для образцов. Закройте крышку и закройте камеру.Запрограммируйте гамма-облучатель так, чтобы он подвергал животных облучению всего тела 12 серыми. Затем поверните клавишу в исходное положение и нажмите «Пуск», чтобы начать экспозицию. Оставьте помещение на время активного воздействия.По истечении заданного времени машина автоматически остановится и начнет издавать звуковой сигнал. Выключите машину, повернув ключ в стоп-положение. Откройте камеру для образцов и снимите крышку.Перенесите животных в клетку и продезинфицируйте камеру для образцов 70% этанолом. Переведите животных обратно в обычную комнату содержания и наблюдайте за их состоянием после лечения. Следите за весом животных каждый день.За три часа до запланированной эвтаназии продезинфицируйте область живота и введите мышам внутрибрюшинно 100 микролитров исходного раствора EdU с помощью инсулинового шприца 28-го калибра. После эвтаназии животного собирают проксимальный отдел кишечника в разные моменты времени после облучения. Рассекают проксимальную часть тонкой кишки и удаляют прикрепленные ткани.Промойте ткань холодным DPBS с помощью прямой иглы для кормления 16-го калибра, прикрепленной к 10-миллилитровому шприцу, и зафиксируйте ткань фиксирующим буфером Буэна. Разрежьте кишки, открытые в продольном направлении, и сверните проксимальные кишки, используя технику швейцарского ролла. Поместите ткани в гистологическую кассету в контейнер с 10%-ным буферным формалином и инкубируйте его в течение 24-48 часов при комнатной температуре.После инкубации переведите гистологические кассеты на 70%-ный этанол, а ткань погрузите в парафин. После заделки поместите гистологические кассеты на лед не менее чем на один час. Затем вырежьте горизонтальные срезы толщиной пять микрон с помощью микротома.Перенесите срезы тканей на водяную баню, разогретую до 45 градусов по Цельсию, и поместите срезы на заряженные предметные стекла. Оставьте предметные стекла на решетке на ночь при комнатной температуре для высыхания. Изображения гематоксилина и эозина образцов тонкой кишки показали гомеостатический кишечный эпителий в нулевом часе с последующей потерей клеток в компартментах крипт во время апоптотической фазы.За этим последовала регенеративная фаза, в которой высокопролиферативные клетки заполнили крипты, что привело к фазе нормализации к седьмому дню. Отслеживание происхождения с помощью EYFP показало, что во время гомеостаза клетки, происходящие из стволовых клеток с положительным резервом Bmi1, были ограничены плюс-четырьмя-шестью позициями в криптах. Окрашивание EdU и Ki-67 показало нормальный гомеостаз кишечника у фиктивно облученных мышей, простирающийся от активных стволовых клеток через транзитно-амплифицирующую зону.Во время апоптотической фазы количество EYFP-положительных клеток уменьшалось, что сопровождалось потерей пролиферативных клеток, вызванной радиационным повреждением. В регенеративной фазе наблюдалась активация резервных стволовых клеток и быстрая пролиферация Bmi1-положительных клеток. Дальнейшая пролиферация и миграция восстановили целостность кишечного эпителия.Окрашивание TUNEL показало, что апоптотические клетки отсутствуют во время гомеостаза. Увеличение окрашивания TUNEL наблюдалось в конце апоптотической фазы. Во время регенеративной фазы окрашивание TUNEL неуклонно уменьшалось в регенерирующих криптах и почти отсутствовало, когда крипты нормализовались.Этот метод можно комбинировать с секвенированием РНК, секвенированием одноклеточной РНК, сортировкой клеток, активируемой флуоресценцией, или протеомным анализом, чтобы получить более глубокие знания о роли конкретных клеточных линий во время регенерации кишечника после травмы. Исследователи могут исследовать взаимодействие между микробиотой и популяциями эпителиальных, стромальных и иммунных клеток в регенерации кишечника, чтобы расширить понимание регенеративной способности кишечного эпителия.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Корковая Нейрогенез: Переход от Достижения в лаборатории для клеточной терапии

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Оценка пространственного распределения γH2AX следующие ионизирующих излучений

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Система для культивирования Ирис пигмента эпителиальных клеток по изучению регенерации линз в Ньют

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Лазерной абляции предпочки данио рерио по изучению почечных эпителиальных Регенерация

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Измерение глутатион-индуцированной кормления ответ в Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro и In Vivo подходы для определения проницаемости кишечной эпителиальных клеток

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.