Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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Los autores desean agradecer al Núcleo de Investigación de Histología del Centro de Cáncer de Stony Brook por la asistencia experta con la preparación de muestras de tejido y a la División de Recursos para Animales de Laboratorio de la Universidad de Stony Brook por su asistencia con el cuidado y manejo de animales. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DK124342 otorgadas a Agnieszka B. Bialkowska y DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Todos los ratones fueron alojados en la División de Recursos para Animales de Laboratorio (DLAR) de la Universidad de Stony Brook. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook (IACUC) aprobó todos los estudios y procedimientos que involucran sujetos animales. Los experimentos con sujetos animales se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con el protocolo aprobado de manejo de animales (IACUC # 245094).
NOTA: Las cepas de ratón B6;129-Bmi1 tm1(cre/...

Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Permite el análisis preciso de los cambios en el epitelio intestinal en el transcurso de 7 días después de la lesión. Es importante destacar que los puntos de tiempo seleccionados reflejan etapas cruciales de la lesión y se caracterizan por distintas alteraciones en el intestino (fases de lesión, apoptosis, regeneración y normalización)60. Este modelo de irradiación ha sido establecido y evaluado cuidadosa...

El epitelio intestinal humano cubriría aproximadamente la superficie de la mitad de una cancha de bádminton si se colocara completamente plano1. En cambio, esta capa de una sola célula que separa a los humanos del contenido de sus intestinos se compacta en una serie de proyecciones en forma de dedos, vellosidades y hendiduras, criptas que maximizan el área de superficie de los intestinos. Las células del epitelio se diferencian a lo largo de un eje cripta-vellosidad. Las vellosidades consisten principalmente en enterocitos que absorben nutrientes, células caliciformes secretoras de moco y células enteroendocrinas productoras de hormonas, mientras que las criptas consisten principalmente en células de Paneth productoras de defensina, células madre activas y de reserva, y células progenitoras 2,3,4,5. Además, la comunicación bidireccional que estas células tienen con las células estromales e inmunes del compartimiento mesenquimal subyacente y la microbiota de la luz generan una compleja red de interacciones que mantiene la homeostasis intestinal y es crítica para la recuperación después de una lesión 6,7,8.
El epitelio intestinal es el tejido que se auto-renueva más rápidamente en el cuerpo humano, con una tasa de renovación de 2-6 días 9,10,11. Durante la homeostasis, las células madre activas en la base de las criptas intestinales (células columnares de la base de la cripta), marcadas por la expresión del receptor acoplado a proteína G 5 rico en leucina (LGR5), se dividen rápidamente y proporcionan células progenitoras que se diferencian en todos los demás linajes epiteliales intestinales. Sin embargo, debido a su alta tasa mitótica, las células madre activas y sus progenitores inmediatos son particularmente sensibles a la lesión por radiación gamma y sufren apoptosis después de la irradiación 5,12,13,14. Tras su pérdida, las células madre de reserva y las células no madre (subpoblación de progenitores y algunas células terminalmente diferenciadas) dentro de las criptas intestinales se activan y reponen el compartimiento de la cripta basal, que luego puede reconstituir las poblaciones celulares de las vellosidades y, por lo tanto, regenerar el epitelio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreo de linaje, múltiples grupos de investigación han demostrado que las células madre de reserva (quiescentes) son capaces de apoyar la regeneración tras la pérdida de células madre activas 13,16,17,18,19,20,21,22. Estas células se caracterizan por la presencia del oncogén de la proteína 1 del complejo polycomb (Bmi1), el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa de ratón (mTert), el homeobox del lúpulo (Hopx) y el gen de la proteína 1 de repetición rica en leucina (Lrig1). Además, se ha demostrado que las células no madre son capaces de reponer las criptas intestinales tras una lesión 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particular, se ha demostrado que los progenitores de células secretoras y enterocitos sufren desdiferenciación tras una lesión, vuelven a células madre y apoyan la regeneración del epitelio intestinal. Estudios recientes han identificado células que expresan múltiples marcadores que poseen la capacidad de adquirir características similares a las de un tallo tras una lesión (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. demostraron que incluso las células maduras de Paneth (LYZ+) pueden contribuir a la regeneración intestinal37. Además, además de causar apoptosis de las células epiteliales intestinales y alterar la función de barrera epitelial, la irradiación resulta en disbiosis de la flora intestinal, activación de células inmunes y el inicio de una respuesta proinflamatoria, y la activación de células mesenquimales y estromales38,39.
La radiación gamma es una valiosa herramienta terapéutica en el tratamiento del cáncer, especialmente para los tumores colorrectales40. Sin embargo, la irradiación afecta significativamente la homeostasis intestinal al inducir daño a las células, lo que conduce a la apoptosis. La exposición a la radiación causa múltiples perturbaciones que ralentizan la recuperación de un paciente y se caracteriza por lesiones de la mucosa e inflamación en la fase aguda y diarrea, incontinencia, sangrado y dolor abdominal a largo plazo. Esta panoplia de manifestaciones se conoce como toxicidad por radiación gastrointestinal. Además, la progresión inducida por la radiación de la fibrosis transmural y/o la esclerosis vascular sólo puede manifestarse años después del tratamiento38,41. Simultáneamente a la lesión misma, la radiación induce una respuesta de reparación en las células intestinales que activa las vías de señalización responsables de iniciar y orquestar la regeneración42. La enfermedad del intestino delgado inducida por radiación puede originarse a partir de la radioterapia pélvica o abdominal administrada a otros órganos (como cuello uterino, próstata, páncreas, recto)41,43,44,45,46. La lesión por irradiación intestinal es, por lo tanto, un problema clínico importante, y es probable que una mejor comprensión de la fisiopatología resultante avance en el desarrollo de intervenciones para aliviar las complicaciones gastrointestinales asociadas con la radioterapia. Existen otras técnicas que permiten investigar el propósito regenerativo del epitelio intestinal aparte de la radiación. Se han desarrollado modelos murinos transgénicos y químicos para estudiar la inflamación y la regeneración posterior47. El sulfato de sodio de dextrano (DSS) induce inflamación en el intestino y conduce al desarrollo de características similares a las de la enfermedad inflamatoria intestinal48. Una combinación del tratamiento DSS con el compuesto procancerígeno azoximetano (OMA) puede resultar en el desarrollo de cáncer asociado a colitis48,49. La lesión inducida por isquemia por reperfusión es otro método empleado para estudiar el potencial regenerativo del epitelio intestinal. Esta técnica requiere experiencia y conocimientos quirúrgicos50. Además, las técnicas antes mencionadas causan diferentes tipos de lesiones que la radiación y pueden conducir a la participación de diferentes mecanismos de regeneración. Además, estos modelos consumen mucho tiempo, mientras que la técnica de radiación es bastante breve. Recientemente, los métodos in vitro que utilizan enteroides y colonoides generados a partir del intestino y el colon se han utilizado en combinación con lesiones por radiación para estudiar los mecanismos de regeneración intestinal51,52. Sin embargo, estas técnicas no recapitulan completamente el órgano que modelan53,54.
El protocolo presentado incluye la descripción de un modelo murino de lesión por radiación gamma en combinación con un modelo genético que, después del tratamiento con tamoxifeno, permite rastrear linajes originados en la población de células madre de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Este modelo utiliza una irradiación corporal total de 12 Gy, que induce una lesión intestinal lo suficientemente significativa como para activar las células madre de reserva, al tiempo que permite la investigación posterior de la capacidad regenerativa intestinal dentro de los 7 días posteriores a la lesión55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

El epitelio intestinal consiste en una sola capa de células, pero contiene múltiples tipos de células terminalmente diferenciadas, que se generan por la proliferación activa de células madre intestinales ubicadas en la parte inferior de las criptas intestinales. Sin embargo, durante los eventos de lesión intestinal aguda, estas células madre intestinales activas experimentan la muerte celular. La irradiación gamma es un tratamiento contra el cáncer colorrectal ampliamente utilizado que, aunque terapéuticamente eficaz, tiene el efecto secundario de agotar el conjunto activo de células madre. De hecho, los pacientes con frecuencia experimentan síndrome de radiación gastrointestinal mientras se someten a radioterapia, en parte debido al agotamiento activo de las células madre. La pérdida de células madre intestinales activas en criptas intestinales activa un conjunto de células madre intestinales de reserva típicamente quiescentes e induce la desdiferenciación de las células secretoras y precursoras de enterocitos. Si no fuera por estas células, el epitelio intestinal carecería de la capacidad de recuperarse de la radioterapia y otros insultos tisulares importantes. Los nuevos avances en las tecnologías de rastreo de linaje permiten el seguimiento de la activación, diferenciación y migración de las células durante la regeneración y se han empleado con éxito para estudiar esto en el intestino. Este estudio tiene como objetivo representar un método para el análisis de las células dentro del epitelio intestinal del ratón después de una lesión por radiación.

El uso de irradiación corporal total (LCT) de 12 Gy en combinación con el rastreo del linaje genético murino permite un análisis exhaustivo de las consecuencias de la lesión por radiación en el intestino. Para empezar, Bmi1-CreER; Los ratonesRosa26 eYFP recibieron una sola inyección de tamoxifeno, que induce la expresión mejorada de proteína fluorescente amarilla (EYFP) dentro de una población de células madre de reserva Bmi1 + . Dos días después de la inyección de ...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

El tracto gastrointestinal es uno de los órganos más sensibles a las lesiones en los tratamientos radioterapéuticos contra el cáncer. Es simultáneamente un sistema de órganos con una de las capacidades regenerativas más altas después de tales insultos. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

La irradiación gamma es un tratamiento ampliamente utilizado para el cáncer colorrectal. Y aunque es terapéuticamente eficaz, tiene efectos negativos en el tracto gastrointestinal. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la activación, diferenciación y migración de células durante la regeneración después de una lesión por radiación.Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Es importante destacar que este modelo permite rastrear el destino de las células intestinales después de una lesión y, por lo tanto, proporciona una mejor comprensión de la capacidad regenerativa de una subpoblación celular específica. Esta técnica puede emplear distintos modelos animales de rastreo de linaje para estudiar el comportamiento en tiempo real y la interacción de varias subpoblaciones de células después de la lesión.Las modificaciones menores a este protocolo deberían permitir la investigación de las relaciones entre la microbiota y diferentes poblaciones de células epiteliales, estromales e inmunes tras una lesión por radiación. Para comenzar, resuspenda el polvo de tamoxifeno en aceite de maíz estéril a una concentración de 30 microgramos por microlitro. Sonicate durante tres minutos en ciclos de encendido y apagado de 30 segundos con una amplitud del 60%.Mezclar por rotación en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Luego, prepare EdU agregando DMSO estéril al polvo de EdU. Agregue 1/5 del volumen total y agregue lentamente el volumen restante de agua ultrapura estéril.Cuando esté completamente disuelto, alícuota y almacenar a 20 grados centígrados. Prepare reactivos para la recolección y fijación de tejidos, como etanol al 70% en agua, DPBS enfriado a cuatro grados centígrados, tampón fijador de Bouin y formalina tamponada al 10%. A continuación, prepare el equipo necesario, como un kit de disección de ratones, placas de Petri, una aguja de sonda de calibre 16 conectada a una jeringa de 10 mililitros y casetes histológicos.Dos días antes de la exposición a la irradiación gamma, prepare a los animales de experimentación para la inyección de tamoxifeno. Pese cada animal y calcule la dosis requerida. Desinfectar la zona abdominal con etanol al 70%.Luego, administre una dosis única de tamoxifeno por vía intraperitoneal usando una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro para inducir la recombinación mediada por Cre. Observe a los animales durante las próximas 48 horas para excluir la posible toxicidad del tamoxifeno. Después de 48 horas, transfiera a los animales a la sala de irradiación.Desinfecte la cámara de muestras en el irradiador gamma con solución de etanol al 70%. Coloque la estera absorbente y los animales dentro de la cámara de muestra. Coloque la tapa y cierre la cámara.Programe el irradiador gamma para exponer a los animales a 12 irradiación corporal total gris. Luego, gire la tecla a la posición inicial y presione inicio para iniciar la exposición. Salga de la habitación para el tiempo de exposición activa.Después de que haya transcurrido el tiempo preestablecido, la máquina se detendrá automáticamente y comenzará a emitir pitidos. Apague la máquina girando la llave en la posición de parada. Abra la cámara de muestras y retire la tapa.Transfiera los animales a la jaula y desinfecte la cámara de muestras con etanol al 70%. Transfiera a los animales de regreso a la sala de alojamiento convencional y observe su condición después del tratamiento. Controle el peso de los animales todos los días.Tres horas antes de la eutanasia planificada, desinfecte el área abdominal e inyecte a los ratones por vía intraperitoneal con 100 microlitros de solución madre de EdU con una jeringa de insulina de calibre 28. Después de la eutanasia del animal, recoja los intestinos proximales en diferentes puntos de tiempo después de la irradiación. Diseccionar la parte proximal del intestino delgado y eliminar los tejidos adheridos.Enjuague el tejido con DPBS frío con una aguja de alimentación recta de calibre 16 conectada a una jeringa de 10 mililitros y fije el tejido con el tampón fijador de Bouin. Corte los intestinos abiertos longitudinalmente y enrolle los intestinos proximales utilizando la técnica de rollo suizo. Coloque los tejidos en un casete histológico en un recipiente con formalina tamponada al 10% e incube durante 24 a 48 horas a temperatura ambiente.Después de la incubación, transfiera los casetes histológicos al etanol al 70% e incruste el tejido en parafina. Después de la incrustación, coloque los casetes histológicos en hielo durante al menos una hora. Luego, corte secciones horizontales de cinco micras de espesor con un micrótomo.Transfiera las secciones de tejido a un baño de agua calentado hasta 45 grados centígrados y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente. Las imágenes de hematoxilina y eosina de muestras del intestino delgado mostraron un epitelio intestinal homeostático en hora cero, seguido de la pérdida de células dentro de los compartimentos de la cripta durante la fase apoptótica.Esto fue seguido por la fase regenerativa en la que las células altamente proliferativas poblaron las criptas, lo que llevó a la fase de normalización en el día siete. El rastreo de linaje por EYFP mostró que durante la homeostasis, las células que se originan a partir de células madre de reserva positivas Bmi1 se restringieron a las posiciones más cuatro a más seis dentro de las criptas. La tinción de EdU y Ki-67 mostró homeostasis intestinal normal en ratones irradiados simuladamente, que se extiende desde las células madre activas a través de la zona de amplificación del tránsito.Durante la fase apoptótica, el número de células positivas para EYFP disminuyó, acompañado de una pérdida de células proliferativas causada por el daño por radiación. En la fase regenerativa, se observó la activación de células madre de reserva y la rápida proliferación de células positivas para Bmi1. Una mayor proliferación y migración restauró la integridad del epitelio intestinal.La tinción TUNEL mostró que las células apoptóticas están ausentes durante la homeostasis. Se observó un aumento en la tinción de TUNEL al final de la fase apoptótica. Durante la fase regenerativa, la tinción TUNEL disminuyó constantemente dentro de las criptas regeneradoras y estuvo casi ausente cuando las criptas se normalizaron.Esta técnica se puede combinar con la secuenciación de ARN, la secuenciación de ARN unicelular, la clasificación celular activada por fluorescencia o el análisis proteómico para obtener un conocimiento más profundo sobre el papel de linajes celulares específicos durante la regeneración intestinal después de una lesión. Los investigadores pueden investigar las interacciones entre la microbiota y las poblaciones de células epiteliales, estromales e inmunes en la regeneración intestinal para ampliar la comprensión de la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

La neurogénesis cortical: La transición de los avances en el Laboratorio de terapias basadas en células

Investigación

Biología

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Medición inducida glutatión-Alimentación Respuesta en Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.