Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Författarna vill erkänna Stony Brook Cancer Center Histology Research Core för experthjälp med beredning av vävnadsprover och avdelningen för laboratoriedjurresurser vid Stony Brook University för hjälp med djurvård och hantering. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health DK124342 som tilldelades Agnieszka B. Bialkowska och DK052230 till Dr. Vincent W. Yang.

Alla möss var inrymda i avdelningen för laboratoriedjurresurser (DLAR) vid Stony Brook University. Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkände alla studier och förfaranden som involverade djurämnen. Försök med försökspersoner utfördes strikt i enlighet med det godkända djurhanteringsprotokollet (IACUC #245094).
OBS: Musstammarna B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) och B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26...

Detta protokoll beskriver en robust och reproducerbar strålskademodell. Det möjliggör en exakt analys av förändringarna i tarmepitelet under 7 dagar efter skada. Det är viktigt att de valda tidpunkterna återspeglar avgörande stadier av skada och kännetecknas av tydliga förändringar i tarmen (skada, apoptos, regenerering och normaliseringsfaser)60. Denna bestrålningsmodell har fastställts och noggrant utvärderats, vilket visar en lämplig manifestation av skada för att efterlikna den...

Det mänskliga tarmepitelet skulle täcka ungefär ytan på en halv badmintonbana om den placerades helt platt1. Istället komprimeras detta enda cellskikt som skiljer människor från innehållet i deras tarmar i en serie fingerliknande utsprång, villi och indragningar, krypter som maximerar tarmarnas yta. Epitelets celler skiljer sig längs en krypt-villusaxel. Villusen består huvudsakligen av näringsabsorberande enterocyter, slemutsöndrande bägarceller och de hormonproducerande enteroendokrina cellerna, medan kryptorna huvudsakligen består av defensinproducerande Paneth-celler, aktiva stamceller och reservstamcellersamt stamceller 2,3,4,5. Vidare genererar den dubbelriktade kommunikationen som dessa celler har med stroma- och immuncellerna i det underliggande mesenkymala facket och lumenets mikrobiota ett komplext nätverk av interaktioner som upprätthåller tarmhomeostas och är avgörande för återhämtning efter skada 6,7,8.
Tarmepitelet är den snabbaste självförnyande vävnaden i människokroppen, med en omsättningshastighet på 2-6 dagar 9,10,11. Under homeostas delar aktiva stamceller vid basen av tarmkrypter (kryptbaskolonnceller), markerade av uttrycket av leucinrika upprepade innehållande G-proteinkopplad receptor 5 (LGR5), snabbt och tillhandahåller stamceller som differentieras till alla andra tarmepitellinjer. På grund av sin höga mitotiska hastighet är aktiva stamceller och deras omedelbara förfäder särskilt känsliga för gammastrålningsskador och genomgår apoptos efter bestrålning 5,12,13,14. Vid deras förlust genomgår reservstamceller och icke-stamceller (subpopulation av förfäder och vissa terminalt differentierade celler) i tarmkrypter aktivering och fyller på basalkryptfacket, vilket sedan kan rekonstruera cellpopulationer av villi och därmed regenerera tarmepitelet15. Med hjälp av härstamningsspårningstekniker har flera forskargrupper visat att reservstamceller (vilande) kan stödja regenerering vid förlust av aktiva stamceller 13,16,17,18,19,20,21,22. Dessa celler kännetecknas av närvaron av polykamkomplexprotein 1 onkogen (Bmi1), mustelomeras omvänd transkriptasgen (mTert), Hop homeobox (Hopx) och leucinrikt upprepat protein 1-gen (Lrig1). Dessutom har det visats att icke-stamceller kan fylla på tarmkrypter vid skada 23,24,25,26,27,28,29,30,31. I synnerhet har det visats att föregångare till sekretoriska celler och enterocyter genomgår dedifferentiering vid skada, återgår till stamliknande celler och stöder regenerering av tarmepitelet. Nya studier har identifierat celler som uttrycker flera markörer som har förmågan att förvärva stamliknande egenskaper vid skada (såsom DLL +, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Överraskande visade Yu et al. att även mogna Paneth-celler (LYZ +) kan bidra till tarmregenerering37. Förutom att orsaka apoptos av tarmepitelceller och störa epitelbarriärfunktionen resulterar bestrålning dessutom i dysbios av tarmfloran, immuncellsaktivering och initiering av ett proinflammatoriskt svar och aktivering av mesenkymala och stromaceller38,39.
Gammastrålning är ett värdefullt terapeutiskt verktyg vid cancerbehandling, särskilt för kolorektala tumörer40. Bestrålning påverkar emellertid signifikant tarmhomeostas genom att inducera skador på cellerna, vilket leder till apoptos. Strålningsexponering orsakar flera störningar som saktar ner patientens återhämtning och kännetecknas av slemhinneskada och inflammation i den akuta fasen och diarré, inkontinens, blödning och buksmärta på lång sikt. Denna panoply av manifestationer kallas gastrointestinal strålningstoxicitet. Dessutom kan strålningsinducerad progression av transmural fibros och / eller vaskulär skleros endast manifestera år efter behandlingen38,41. Samtidigt med själva skadan inducerar strålning ett reparationssvar i tarmceller som aktiverar signalvägar som är ansvariga för att initiera och orkestrera regenerering42. Strålningsinducerad tunntarmssjukdom kan härröra från strålbehandling av bäcken eller buk som ges till andra organ (såsom livmoderhals, prostata, bukspottkörtel, rektum)41,43,44,45,46. Tarmbestrålningsskada är således en betydande klinisk fråga, och en bättre förståelse av den resulterande patofysiologin kommer sannolikt att främja utvecklingen av interventioner för att lindra gastrointestinala komplikationer i samband med strålbehandling. Det finns andra tekniker som gör det möjligt att undersöka det regenerativa syftet med tarmepitelet förutom strålning. Transgena och kemiska murina modeller för att studera inflammation och regenerering därefter har utvecklats47. Dextrannatriumsulfat (DSS) inducerar inflammation i tarmen och leder till utveckling av egenskaper som liknar inflammatoriska tarmsjukdomar48. En kombination av DSS-behandling med den pro-cancerframkallande föreningen azoxymetan (AOM) kan resultera i utveckling av kolitassocierad cancer48,49. Ischemi-reperfusionsinducerad skada är en annan metod som används för att studera tarmepitelets regenerativa potential. Denna teknik kräver erfarenhet och kirurgisk kunskap50. Dessutom orsakar de ovan nämnda teknikerna andra typer av skador än strålning och kan leda till involvering av olika regenereringsmekanismer. Dessutom är dessa modeller tidskrävande, medan strålningstekniken är ganska kort. Nyligen har in vitro-metoder som använder enteroider och kolonoider genererade från tarmen och tjocktarmen använts i kombination med strålskada för att studera mekanismerna för tarmregenerering51,52. Dessa tekniker rekapitulerar dock inte helt det organ de modellerar53,54.
Det protokoll som presenteras innehåller en beskrivning av en murin modell av gammastrålningsskada i kombination med en genetisk modell som, efter tamoxifenbehandling, tillåter spårning av släktlinjer som härrör från reservstamcellspopulationen (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Denna modell använder en 12 Gy bestrålning av hela kroppen, vilket inducerar tillräckligt stor tarmskada för att aktivera reservstamceller samtidigt som den möjliggör efterföljande undersökning av tarmregenerativ förmåga inom 7 dagar efter skada55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

Tarmepitelet består av ett enda lager av celler men innehåller flera typer av terminalt differentierade celler, vilka genereras av aktiv proliferation av tarmstamceller belägna i botten av tarmkrypter. Men under händelser med akut tarmskada genomgår dessa aktiva tarmstamceller celldöd. Gammabestrålning är en allmänt använd kolorektal cancerbehandling, som, även om den är terapeutiskt effektiv, har bieffekten att tömma den aktiva stamcellspoolen. Faktum är att patienter ofta upplever gastrointestinalt strålningssyndrom medan de genomgår strålbehandling, delvis på grund av aktiv stamcellsutarmning. Förlusten av aktiva tarmstamceller i tarmkrypter aktiverar en pool av typiskt vilande reservtarmstamceller och inducerar dedifferentiering av sekretoriska och enterocytprekursorceller. Om inte för dessa celler skulle tarmepitelet sakna förmågan att återhämta sig från strålbehandling och andra sådana stora vävnadsförolämpningar. Nya framsteg inom härstamningsspårningsteknik möjliggör spårning av aktivering, differentiering och migration av celler under regenerering och har framgångsrikt använts för att studera detta i tarmen. Denna studie syftar till att avbilda en metod för analys av celler i musens tarmepitel efter strålskada.

Användningen av 12 Gy totalkroppsbestrålning (TBI) i kombination med murin genetisk härstamningsspårning möjliggör en grundlig analys av konsekvenserna av strålskador i tarmen. För att starta, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-möss fick en enda tamoxifeninjektion, vilket inducerar förbättrat gulfluorescerande protein (EYFP) uttryck inom en Bmi1 + reservstamcellspopulation. Två dagar efter tamoxifeninjektionen genomgick mössen bestrålning eller skenbestrålning. Tre timmar för...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Mag-tarmkanalen är ett av de mest känsliga organen för skador vid radioterapeutiska cancerbehandlingar. Det är samtidigt ett organsystem med en av de högsta regenerativa kapaciteterna efter sådana förolämpningar. Det presenterade protokollet beskriver en effektiv metod för att studera tarmepitelets regenerativa kapacitet.

Intestinal epitelregenerering som svar på joniserande bestrålning

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gammabestrålning är en allmänt använd behandling för kolorektal cancer. Och medan det är terapeutiskt effektivt, har det negativa effekter på mag-tarmkanalen. Det presenterade protokollet beskriver en effektiv metod för att studera aktivering, differentiering och migration av celler under regenerering efter strålskada.Detta protokoll beskriver en robust och reproducerbar strålskademodell. Viktigt är att denna modell gör det möjligt att spåra tarmcellens öde efter skada och därmed ge bättre förståelse för regenerativ kapacitet hos specifik cellsubpopulation. Denna teknik kan använda distinkta härstamningsspårande djurmodeller för att studera realtidsbeteendet och interaktionen mellan olika subpopulationer av celler efter skada.Mindre ändringar av detta protokoll bör möjliggöra undersökning av relationerna mellan mikrobiota och olika epitelial-, stroma- och immuncellspopulationer vid strålskada. Börja med att resuspendera tamoxifenpulver i steril majsolja i en koncentration av 30 mikrogram per mikroliter. Sonicate i tre minuter i 30 sekunder on-off cykler med 60%amplitud.Blanda genom rotation i mörkret i en timme vid rumstemperatur. Förbered sedan EdU genom att tillsätta steril DMSO till EdU-pulver. Tillsätt 1/5 av den totala volymen och tillsätt långsamt den återstående volymen sterilt ultrarent vatten.När den är helt upplöst, alikvot och förvara vid 20 grader Celsius. Förbered reagens för vävnadsinsamling och fixering, såsom 70% etanol i vatten, DPBS kyld till fyra grader Celsius, Bouins fixativa buffert och 10% buffrad formalin. Förbered sedan nödvändig utrustning, såsom ett mössdissektionssats, petriskålar, en 16-gauge sondnål fäst vid en 10-milliliter spruta och histologiska kassetter.Två dagar före gammabestrålningsexponering, förbered försöksdjuren för tamoxifeninjektion. Väg varje djur och beräkna den dos som krävs. Desinficera bukområdet med 70% etanol.Administrera sedan en enstaka dos tamoxifen intraperitonealt med hjälp av en 27-gauge nål fäst vid en en-milliliter spruta för att inducera Cre-medierad rekombination. Observera djur under de närmaste 48 timmarna för att utesluta potentiell tamoxifentoxicitet. Efter 48 timmar, överför djuren till bestrålningsrummet.Desinficera provkammaren i gammastrålaren med 70% etanollösning. Placera den absorberande mattan och djuren inuti provkammaren. Placera locket och stäng kammaren.Programmera gammastrålningen för att utsätta djur för 12 grå bestrålning av hela kroppen. Vrid sedan knappen till startpositionen och tryck på start för att initiera exponeringen. Lämna rummet för aktiv exponeringstid.När den förinställda tiden har gått stannar maskinen automatiskt och börjar pipa. Stäng av maskinen genom att vrida nyckeln till stoppläget. Öppna provkammaren och ta av locket.Överför djuren till buren och desinficera provkammaren med 70 % etanol. Överför djuren tillbaka till det konventionella stallet och observera deras tillstånd efter behandlingen. Övervaka djurens vikt varje dag.Tre timmar före den planerade dödshjälpen, desinficera bukområdet och injicera mössen intraperitonealt med 100 mikroliter EdU-stamlösning med en 28-gauge insulinspruta. Efter avlivning av djuret, samla de proximala tarmarna vid olika tidpunkter efter bestrålning. Dissekera den proximala delen av tunntarmen och ta bort bifogade vävnader.Spola vävnaden med kall DPBS med en 16-gauge rak matningsnål fäst vid en 10-milliliter spruta och fixera vävnaden med Bouins fixativa buffert. Skär tarmarna öppna i längdriktningen och rulla de proximala tarmarna med hjälp av Swiss-roll-tekniken. Placera vävnaderna i en histologisk kassett i en behållare med 10% buffrat formalin och inkubera det i 24 till 48 timmar vid rumstemperatur.Efter inkubation, överför de histologiska kassetterna till 70% etanol och bädda in vävnaden i paraffin. Efter inbäddning, placera de histologiska kassetterna på is i minst en timme. Skär sedan fem mikron tjocka horisontella sektioner med en mikrotom.Överför vävnadssektionerna till ett vattenbad uppvärmt till 45 grader Celsius och placera sektionerna på laddade objektglas. Lämna bilderna på ett galler över natten vid rumstemperatur för att torka. Hematoxylin- och eosinbilder av tunntarmsprover visade ett homeostatiskt tarmepitel vid noll timme, följt av förlust av celler i kryptfack under den apoptotiska fasen.Detta följdes av den regenerativa fasen där mycket proliferativa celler befolkade krypterna, vilket ledde till normaliseringsfasen vid dag sju. Släktspårning av EYFP visade att under homeostas var cellerna från Bmi1-positiva reservstamceller begränsade till plus fyra till plus sex positioner inom krypter. EdU- och Ki-67-färgning visade normal tarmhomeostas hos bestrålade möss, som sträckte sig från aktiva stamceller genom transitförstärkande zonen.Under den apoptotiska fasen minskade antalet EYFP-positiva celler, åtföljt av en förlust av proliferativa celler orsakade av strålningsskador. I den regenerativa fasen observerades aktivering av reservstamceller och snabb proliferation av Bmi1-positiva celler. Ytterligare proliferation och migration återställde tarmepitelintegriteten.TUNEL-färgning visade att apoptotiska celler saknas under homeostas. En ökning av TUNEL-färgning observerades sent i den apoptotiska fasen. Under den regenerativa fasen minskade TUNEL-färgningen stadigt inom de regenererande krypterna och var nästan frånvarande när krypterna normaliserades.Denna teknik kan kombineras med RNA-sekvensering, encells-RNA-sekvensering, fluorescensaktiverad cellsortering eller proteomisk analys för att få mer fördjupad kunskap om rollen av specifika cellinjer under tarmregenerering efter skada. Forskarna kan undersöka interaktionerna mellan mikrobiota och epiteliala, stromala och immuncellspopulationer vid tarmregenerering för att utöka förståelsen för tarmepitelets regenerativa förmåga.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikala Neurogenesis: Övergång från Förskott i laboratoriet för att cellbaserade terapier

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Utvärdering av den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ett system för odling Iris Pigment epitelceller att studera Lens Regenerering vid Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation av Zebrafish Pronephros att studera Nedsatt Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mätning Glutation-inducerad Foder Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro och In Vivo -metoder för att fastställa tarmens epitelceller permeabilitet

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.