Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Yazarlar, doku örneği hazırlama konusunda uzman yardımı için Stony Brook Kanser Merkezi Histoloji Araştırma Çekirdeği'ne ve hayvan bakımı ve kullanımı konusunda yardım için Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'ne teşekkür etmek istemektedir. Bu çalışma, Agnieszka B. Bialkowska'ya verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri DK124342 ve Dr. Vincent W. Yang'a verilen DK052230 hibeleriyle desteklenmiştir.

Tüm fareler, Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'nde (DLAR) barındırıldı. Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), hayvan denekleri içeren tüm çalışmaları ve prosedürleri onayladı. Hayvan denekleri içeren deneyler kesinlikle onaylanmış hayvan işleme protokolüne (IACUC #245094) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Fare suşları B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-CreER</e...

Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Yaralanma sonrası 7 gün boyunca bağırsak epitelindeki değişikliklerin hassas analizine izin verir. Önemli olarak, seçilen zaman noktaları yaralanmanın önemli aşamalarını yansıtır ve bağırsakta belirgin değişiklikler (yaralanma, apoptoz, rejenerasyon ve normalleşme aşamaları) ile karakterize edilir60. Bu ışınlama modeli, radyoterapi gören hastaların yaşadığı taklit yaralanmasının uygu...

İnsan bağırsak epiteli, tamamen düz1 yerleştirilirse yaklaşık yarım badminton kortunun yüzeyini kaplar. Bunun yerine, insanları bağırsaklarının içeriğinden ayıran bu tek hücre tabakası, bağırsakların yüzey alanını en üst düzeye çıkaran bir dizi parmak benzeri çıkıntı, villus ve girinti, kriptlere sıkıştırılır. Epitelin hücreleri bir kript-villus ekseni boyunca farklılaşır. Villus öncelikle besin emici enterositlerden, mukus salgılayan kadeh hücrelerinden ve hormon üreten enteroendokrin hücrelerden oluşurken, kriptler öncelikle savunma üreten Paneth hücreleri, aktif ve rezerv kök hücreler ve progenitör hücrelerdenoluşur 2,3,4,5. Ayrıca, bu hücrelerin altta yatan mezenkimal kompartmanın stromal ve immün hücreleri ve lümenin mikrobiyotası ile sahip olduğu çift yönlü iletişim, bağırsak homeostazını koruyan ve yaralanma sonrası iyileşme için kritik olan karmaşık bir etkileşim ağı oluşturur 6,7,8.
Bağırsak epiteli, insan vücudunda en hızlı kendini yenileyen dokudur ve 2-6 günlük bir devir hızı 9,10,11'dir. Homeostaz sırasında, lösin bakımından zengin tekrar içeren G-protein eşleşmiş reseptör 5'in (LGR5) ekspresyonu ile işaretlenmiş bağırsak kriptlerinin tabanındaki aktif kök hücreler (kript baz sütunlu hücreler), hızla bölünür ve diğer tüm bağırsak epitel soylarına farklılaşan progenitör hücreler sağlar. Bununla birlikte, yüksek mitotik oranları nedeniyle, aktif kök hücreler ve acil progenitörleri gama radyasyonu hasarına karşı özellikle hassastır ve ışınlama sonrası apoptozauğrarlar 5,12,13,14. Kayıpları üzerine, bağırsak kriptleri içindeki kök hücreleri ve kök olmayan hücreleri (progenitörlerin alt popülasyonu ve bazı terminal olarak farklılaşmış hücreler) aktivasyona uğrar ve bazal kript bölmesini yeniler, bu da daha sonra villusun hücre popülasyonlarını yeniden oluşturabilir ve böylece bağırsak epiteli15'i yenileyebilir. Soy izleme tekniklerini kullanan çok sayıda araştırma grubu, rezerv (sessiz) kök hücrelerin aktif kök hücrelerin kaybı üzerine rejenerasyonu destekleyebildiğini göstermiştir 13,16,17,18,19,20,21,22. Bu hücreler, polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), fare telomeraz ters transkriptaz geni (mTert), Hop homeobox (Hopx) ve lösin bakımından zengin tekrar protein 1 geninin (Lrig1) varlığı ile karakterize edilir. Ek olarak, kök olmayan hücrelerin yaralanma üzerine bağırsak kriptlerini yenileyebildiği gösterilmiştir 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Özellikle, salgı hücrelerinin ve enterositlerin progenitörlerinin yaralanma üzerine dediferansiyasyona uğradığı, kök benzeri hücrelere geri döndüğü ve bağırsak epitelinin yenilenmesini desteklediği gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, yaralanma üzerine kök benzeri özellikler kazanma kapasitesine sahip çoklu belirteçleri eksprese eden hücreleri tanımlamıştır (DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 + gibi)32,33,34,35,36. Şaşırtıcı bir şekilde, Yu ve ark. olgun Paneth hücrelerinin (LYZ +) bile bağırsak yenilenmesine katkıda bulunabileceğini göstermiştir37. Ayrıca, intestinal epitel hücrelerinin apoptozuna neden olmanın ve epitel bariyer fonksiyonunu bozmanın yanı sıra, ışınlama bağırsak florasının disbiyozu, immün hücre aktivasyonu ve pro-inflamatuar yanıtın başlatılması ve mezenkimal ve stromal hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanır38,39.
Gama radyasyonu, kanser tedavisinde, özellikle kolorektal tümörler için değerli bir terapötik araçtır40. Bununla birlikte, ışınlama, hücrelere zarar vererek bağırsak homeostazını önemli ölçüde etkiler ve bu da apoptoza yol açar. Radyasyona maruz kalma, hastanın iyileşmesini yavaşlatan çoklu pertürbasyonlara neden olur ve akut fazda mukozal yaralanma ve iltihaplanma ve ishal, idrar kaçırma, kanama ve uzun vadede karın ağrısı ile işaretlenir. Bu tezahür panoply, gastrointestinal radyasyon toksisitesi olarak adlandırılır. Ek olarak, transmural fibroz ve / veya vasküler sklerozun radyasyona bağlı ilerlemesi ancak tedaviden yıllar sonra ortaya çıkabilir38,41. Yaralanmanın kendisiyle eşzamanlı olarak, radyasyon bağırsak hücrelerinde rejenerasyonu başlatmaktan ve düzenlemekten sorumlu sinyal yollarını aktive eden bir onarım tepkisi indükler42. Radyasyona bağlı ince bağırsak hastalığı, diğer organlara (serviks, prostat, pankreas, rektum gibi) verilen pelvik veya abdominal radyoterapiden kaynaklanabilir41,43,44,45,46. Bu nedenle intestinal ışınlama hasarı önemli bir klinik konudur ve ortaya çıkan patofizyolojinin daha iyi anlaşılması, radyoterapi ile ilişkili gastrointestinal komplikasyonları hafifletmek için müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir. Bağırsak epitelinin rejeneratif amacını radyasyondan ayrı olarak araştırmaya izin veren başka teknikler de vardır. Enflamasyonu ve daha sonra rejenerasyonu incelemek için transgenik ve kimyasal murin modelleri geliştirilmiştir47. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağırsakta iltihaplanmaya neden olur ve enflamatuar bağırsak hastalığınınkine benzer özelliklerin gelişmesine yol açar48. DSS tedavisinin pro-kanserojen bileşik azoksimetan (AOM) ile kombinasyonu, kolit ile ilişkili kanserin gelişmesine neden olabilir48,49. İskemi reperfüzyonuna bağlı yaralanma, bağırsak epitelinin rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılan başka bir yöntemdir. Bu teknik tecrübe ve cerrahi bilgi gerektirir50. Ayrıca, yukarıda belirtilen teknikler radyasyondan farklı yaralanma türlerine neden olur ve farklı rejenerasyon mekanizmalarının dahil olmasına neden olabilir. Ek olarak, bu modeller zaman alıcıdır, radyasyon tekniği ise oldukça kısadır. Son zamanlarda, bağırsak ve kolondan üretilen enteroidleri ve kolonoidleri kullanan in vitro yöntemler, bağırsak rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için radyasyon hasarı ile birlikte kullanılmıştır51,52. Bununla birlikte, bu teknikler modelledikleri organı tam olarak özetlemez53,54.
Sunulan protokol, tamoksifen tedavisini takiben, rezerv kök hücre popülasyonundan (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Bu model, rezerv kök hücreleri aktive etmek için yeterince önemli bağırsak hasarına neden olan 12 Gy toplam vücut ışınlamasını kullanırken, yaralanmadan sonraki 7 gün içinde bağırsak rejeneratif kapasitesinin daha sonra araştırılmasına izin verir55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

Bağırsak epiteli, tek bir hücre katmanından oluşur, ancak bağırsak kriptlerinin dibinde bulunan bağırsak kök hücrelerinin aktif çoğalmasıyla üretilen çok sayıda terminal farklılaşmış hücre türü içerir. Bununla birlikte, akut bağırsak hasarı olayları sırasında, bu aktif bağırsak kök hücreleri hücre ölümüne uğrar. Gama ışınlaması, terapötik olarak etkili olsa da, aktif kök hücre havuzunu tüketmenin yan etkisine sahip olan, yaygın olarak kullanılan bir kolorektal kanser tedavisidir. Gerçekten de, hastalar kısmen aktif kök hücre tükenmesi nedeniyle radyoterapi görürken sıklıkla gastrointestinal radyasyon sendromu yaşarlar. Bağırsak kriptlerindeki aktif bağırsak kök hücrelerinin kaybı, tipik olarak sessiz rezervli bağırsak kök hücrelerinden oluşan bir havuzu aktive eder ve sekretuar ve enterosit öncü hücrelerinin farklılaşmasını indükler. Bu hücreler için olmasaydı, bağırsak epiteli radyoterapi ve diğer büyük doku hakaretlerinden kurtulma yeteneğinden yoksun olurdu. Soy izleme teknolojilerindeki yeni gelişmeler, rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunun, farklılaşmasının ve göçünün izlenmesine izin verir ve bunu bağırsakta incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışma, radyasyon hasarını takiben fare bağırsak epiteli içindeki hücrelerin analizi için bir yöntem göstermeyi amaçlamaktadır.

Murin genetik soy takibi ile kombinasyon halinde 12 Gy toplam vücut ışınlamasının (TBI) kullanılması, bağırsaktaki radyasyon hasarının sonuçlarının kapsamlı bir analizine izin verir. Başlamak için, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP fareleri, bir Bmi1 + rezerv kök hücre popülasyonunda gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu indükleyen tek bir tamoksifen enjeksiyonu aldı. Tamoksifen enjeksiyonundan iki gün sonra, farelere ışınlama veya sahte ışınla...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Gastrointestinal sistem, radyoterapötik kanser tedavileri üzerine yaralanmaya karşı en hassas organlardan biridir. Aynı zamanda, bu tür hakaretleri takiben en yüksek rejeneratif kapasitelerden birine sahip bir organ sistemidir. Sunulan protokol, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesini incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gama ışınlaması, kolorektal kanser için yaygın olarak kullanılan bir tedavidir. Terapötik olarak etkili olmasına rağmen, gastrointestinal sistem üzerinde olumsuz etkileri vardır. Sunulan protokol, radyasyon hasarından sonra rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunu, farklılaşmasını ve göçünü incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Önemli olarak, bu model yaralanma sonrası bağırsak hücresi kaderini izlemeye izin verir ve böylece spesifik hücre alt popülasyonunun rejeneratif kapasitesinin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu teknik, gerçek zamanlı davranışı ve yaralanma sonrası hücrelerin çeşitli alt popülasyonlarının etkileşimini incelemek için farklı soy izleme hayvan modellerini kullanabilir.Bu protokoldeki küçük değişiklikler, radyasyon hasarı üzerine mikrobiyota ile farklı epitelyal, stromal ve immün hücre popülasyonları arasındaki ilişkilerin araştırılmasına izin vermelidir. Başlamak için, tamoksifen tozunu steril mısır yağında mikrolitre başına 30 mikrogramlık bir konsantrasyonda tekrar askıya alın. % 60 genlik ile 30 saniye açma-kapama döngülerinde üç dakika boyunca sonikasyon.Oda sıcaklığında bir saat boyunca karanlıkta dönerek karıştırın. Ardından, EdU tozuna steril DMSO ekleyerek EdU'yu hazırlayın. Toplam hacmin 1 / 5'ini ekleyin ve kalan steril ultra saf su hacmini yavaşça ekleyin.Tamamen çözündüğünde, aliquot ve 20 santigrat derecede saklayın. Sudaki %70 etanol, dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş DPBS, Bouin'in fiksatif tamponu ve %10 tamponlu formalin gibi doku toplama ve fiksasyon için reaktifler hazırlayın. Daha sonra, bir fare diseksiyon kiti, Petri tabakları, 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge gavage iğnesi ve histolojik kasetler gibi gerekli ekipmanı hazırlayın.Gama ışınlamasına maruz kalmadan iki gün önce, deney hayvanlarını tamoksifen enjeksiyonu için hazırlayın. Her hayvanı tartın ve gerekli dozu hesaplayın. Karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.Daha sonra, Cre aracılı rekombinasyonu indüklemek için bir mililitrelik bir şırıngaya bağlı 27 gauge iğne kullanarak intraperitoneal olarak tek bir tamoksifen dozu uygulayın. Potansiyel tamoksifen toksisitesini dışlamak için önümüzdeki 48 saat boyunca hayvanları gözlemleyin. 48 saat sonra, hayvanları ışınlama odasına aktarın.Gama ışınlayıcısındaki numune odasını %70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. Emici paspası ve hayvanları numune odasının içine yerleştirin. Kapağı yerleştirin ve odayı kapatın.Gama ışınlayıcısını, hayvanları 12 gri toplam vücut ışınlamasına maruz bırakacak şekilde programlayın. Ardından, anahtarı başlangıç konumuna getirin ve pozlamayı başlatmak için başlat tuşuna basın. Aktif pozlama süresi için odayı terk edin.Önceden ayarlanmış süre geçtikten sonra, makine otomatik olarak durur ve bip sesi çıkarmaya başlar. Anahtarı durma konumuna getirerek makineyi kapatın. Numune haznesini açın ve kapağı çıkarın.Hayvanları kafese aktarın ve numune odasını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Hayvanları geleneksel barınma odasına geri aktarın ve tedavi sonrası durumlarını gözlemleyin. Hayvanların ağırlığını her gün izleyin.Planlanan ötenaziden üç saat önce, karın bölgesini dezenfekte edin ve farelere 28 gauge insülin şırıngası kullanarak 100 mikrolitre EdU stok çözeltisi ile intraperitoneal olarak enjekte edin. Hayvanı ötenazi yaptıktan sonra, proksimal bağırsakları ışınlama sonrası farklı zaman noktalarında toplayın. İnce bağırsağın proksimal kısmını diseke edin ve bağlı dokuları çıkarın.10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 16 gauge düz besleme iğnesi kullanarak dokuyu soğuk DPBS ile yıkayın ve dokuyu Bouin'in fiksatif tamponu ile sabitleyin. Bağırsakları uzunlamasına kesin ve Swiss-roll tekniğini kullanarak proksimal bağırsakları yuvarlayın. Dokuları% 10 tamponlu formalin içeren bir kaba histolojik bir kaset içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.İnkübasyondan sonra, histolojik kasetleri% 70 etanol'e aktarın ve dokuyu parafine gömün. Gömdükten sonra, histolojik kasetleri en az bir saat boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından, bir mikrotom kullanarak beş mikron kalınlığında yatay bölümleri kesin.Doku bölümlerini 45 santigrat dereceye kadar ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin. Slaytları kuruması için gece boyunca oda sıcaklığında bir rafta bırakın. İnce bağırsak örneklerinin hematoksilin ve eozin görüntüleri, sıfır saatte homeostatik bir bağırsak epiteli gösterdi ve bunu apoptotik faz sırasında kript bölmelerindeki hücrelerin kaybı izledi.Bunu, yüksek proliferatif hücrelerin kriptleri doldurduğu ve yedinci güne kadar normalleşme aşamasına yol açan rejeneratif faz izledi. EYFP tarafından yapılan soy izlemesi, homeostaz sırasında, Bmi1 pozitif rezerv kök hücrelerinden kaynaklanan hücrelerin, kriptler içindeki artı dört ila artı altı pozisyonla sınırlı olduğunu göstermiştir. EdU ve Ki-67 boyaması, sahte ışınlanmış farelerde, aktif kök hücrelerden transit yükseltici bölgeye kadar uzanan normal bağırsak homeostazı gösterdi.Apoptotik faz sırasında, radyasyon hasarının neden olduğu proliferatif hücrelerin kaybı ile birlikte EYFP-pozitif hücrelerin sayısı azaldı. Rejeneratif fazda, rezerv kök hücrelerin aktivasyonu ve Bmi1-pozitif hücrelerin hızlı proliferasyonu gözlendi. Daha fazla proliferasyon ve migrasyon bağırsak epitel bütünlüğünü yeniden sağladı.TUNEL boyaması, homeostaz sırasında apoptotik hücrelerin bulunmadığını gösterdi. Apoptotik fazda geç dönemde TÜNEL boyamasında artış gözlendi. Rejeneratif faz sırasında, TUNEL boyaması, rejenere kriptler içinde istikrarlı bir şekilde azaldı ve kriptolar normalleştiğinde neredeyse hiç yoktu.Bu teknik, yaralanma sonrası bağırsak rejenerasyonu sırasında spesifik hücre soylarının rolü hakkında daha derinlemesine bilgi toplamak için RNA dizileme, tek hücreli RNA dizileme, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama veya proteomik analiz ile birleştirilebilir. Araştırmacılar, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesinin anlaşılmasını genişletmek için bağırsak rejenerasyonunda mikrobiyota ve epitelyal, stromal ve bağışıklık hücresi popülasyonları arasındaki etkileşimleri araştırabilirler.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikal nöron: Hücre Tabanlı Tedaviler Laboratuvar gelişmeler geçiş

Biyoloji

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.