Name: a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00
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Os autores gostariam de agradecer ao EPSRC (EP/R513313/1) pelo financiamento. Os autores também gostariam de agradecer a R.B Elliot e Son Abattoir em Calow, Chesterfield, por fornecer cabeças de cordeiro e por serem tão complacentes nos estágios iniciais do projeto, Kasia Emery por seu apoio durante todo o desenvolvimento deste protocolo, e Fiona Wright do Departamento de Infecção, Imunidade e Doenças Cardiovasculares da Universidade de Sheffield por processar as amostras de histologia e ser tão incrivelmente útil ao longo deste projeto.

Cabeças de cordeiro do matadouro R.B Elliott e Son foram utilizadas como fonte de amostras de pele neste projeto. Todos os cordeiros foram abatidos para consumo como alimento. Em vez de descartar as cabeças, estas foram reaproveitadas para pesquisa. A aprovação ética não foi necessária, pois o tecido era proveniente de resíduos descartados de matadouros.
1. Esterilização
<ol><li>Desinfetar a pinça antes da recolha das cabeças, tomando pinças limpas e realizando ...

<ol>
	<li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections.">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li><li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds.">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. 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H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections:+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections.">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).</li><li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+healing:+A+review+of+current+management+and+treatments.">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li><li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. 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P., Carty, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Models+of+Biofilm+Infection.">In Vivo Models of Biofilm Infection.</a> Biofilm Infections. , 267-290 (2011).</li><li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis:+Fungal+and+bacterial+synergy.">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li><li>Williams, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans:+An+opinion+informed+by+veterinary+literature.">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).</li><li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model:+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair.">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li><li>Olkowska, E., Gr&#382;ini&#263;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates.">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909 (2022).</li><li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model.">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li></ol>

O desenvolvimento de antimicrobianos é um empreendimento importante, mas caro, que é estimado em cerca de US $ 1 bilhão e leva cerca de 15 anos para ser concluído. Mais de 90% da descoberta de medicamentos antimicrobianos e estudos pré-clínicos de eficácia de medicamentos antimicrobianos são realizados por pesquisadores acadêmicos e pequenas e médias empresas com tipicamente menos de 50 funcionários22. Essas equipes são muito limitadas financeiramente, o que torna calamitosa a falha da...

As infecções de pele são uma questão global importante, com grandes custos econômicos para os profissionais de saúde em todo o mundo. O desenvolvimento de multirresistência e formação de biofilme por patógenos desempenha um papel fundamental na prevalência de feridas não cicatrizantes 1,2,3,4. Como resultado disso, as infecções de pele e tecidos moles são um dos motivos mais comuns para a hospitalização prolongada e posterior readmissão5. Atrasos na cicatrização de feridas são caros tanto para o paciente quanto para os profissionais de saúde, com algumas estimativas sugerindo que cerca de 6,5 milhões de pacientes são afetados anualmente nos EUA. No Reino Unido, infecções de pele e complicações associadas resultam em aproximadamente 75.000 mortes anuais 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) é um formidável patógeno de feridas frequentemente isolado de feridas de pacientes 2,7. A taxa de emergência de multirresistência aumentou drasticamente na década de 2000. Durante esse período, cerca de 60% das infecções bacterianas agudas da pele e da estrutura da pele foram positivas para S. aureusresistente à meticilina 1. O crescente número de cepas multirresistentes entre os estafilococos, e de fato outros patógenos, nas últimas 2 décadas indica uma necessidade urgente de rápido desenvolvimento de antibióticos com novos modos de ação que possam superar a resistência.
No entanto, desde o início dos anos 2000, os programas de descoberta de antibióticos têm sido dominados por tempos de desenvolvimento mais longos e baixas taxas de sucesso, com apenas 17% dos novos antibióticos que entram em ensaios clínicos nos EUA alcançando aprovação no mercado8. Isso sugere uma disparidade entre os resultados dos testes in vitro de antibióticos emergentes e seus resultados clínicos. Pode-se argumentar que essa disparidade se deve em grande parte a diferenças na fisiologia bacteriana durante infecções in vivo e durante métodos microbiológicos convencionais ao testar a eficácia de antibióticos nos estágios pré-clínicos in vitro . Portanto, novos métodos laboratoriais que são mais representativos da fisiologia bacteriana durante a infecção são necessários para melhorar as taxas de sucesso em programas de descoberta de antibióticos.
Os métodos atuais para o estudo de infecções de pele incluem estudos em animais vivos (por exemplo, camundongos), modelos de pele ex vivo (por exemplo, suínos) e modelos de pele 3D projetados por tecidos (por exemplo, humanos)9,10,11,12. Estudos em animais vivos são estritamente regulamentados e têm rendimento relativamente baixo. Em modelos animais, ferimentos e infecções causam sofrimento significativo aos animais e levantam preocupações éticas. Os modelos de pele humana, ex vivo ou de engenharia de tecidos, requerem aprovação ética, conformidade com a legislação local e global (Lei de Tecidos Humanos, Declaração de Helsinque) e há dificuldade em adquirir tecidos, com algumas solicitações levando anos para serem atendidas13,14. Ambos os tipos de modelos são trabalhosos e exigem conhecimentos significativos para garantir o sucesso experimental. Alguns modelos atuais de infecção cutânea ex vivo requerem discos pré-inoculados e aditivos para o leito da ferida para permitir a infecção; embora esses modelos sejam incrivelmente úteis, há limitações no processo de infecção, pois os aditivos limitam a utilização do leito da ferida como fonte de nutrientes10,15,16,17. O modelo descrito neste estudo não utiliza aditivos para o leito da ferida, o que garante que a patologia da infecção e a contagem de células viáveis sejam resultado da utilização direta do leito da ferida como única fonte de nutrientes.
Dada a necessidade de novos métodos laboratoriais, foi desenvolvido um novo modelo ovino ex vivo de alto rendimento de infecções de pele para uso na avaliação da eficácia de antibióticos emergentes. Os estudos de infecção cutânea enfrentam muitos desafios - altos custos, preocupações éticas e modelos que não mostram um quadro completo20,21. Modelos ex vivo e modelos explante 3D permitem uma melhor visualização do processo da doença e do impacto que os tratamentos podem ter a partir de um modelo clinicamente mais relevante. Aqui, a configuração de um novo modelo de pele ovina é descrita, que é simples, reprodutível e clinicamente relevante e tem alto rendimento. A pele ovina foi escolhida porque as ovelhas são um dos grandes mamíferos comumente usados para modelar respostas a infecções in vivo. Além disso, eles estão prontamente disponíveis nos matadouros, garantindo um suprimento constante de pele para pesquisa, e suas carcaças não são escaldadas, garantindo uma boa qualidade do tecido. Este estudo utilizou S. aureus como patógeno exemplar; no entanto, o modelo funciona bem com outros microrganismos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Companion Plate</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, sterile</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colour Pro Style Cordless Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9639-2117X</td>
			<td>Hair Clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>458600-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212&#160;</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, Handheld</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, plastic blending cones</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15585819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert Individual 24 well 0.4um membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (MK media)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, cell culture Costar 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ESI-B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Allis Tissue Forceps</td>
			<td>Rocialle</td>
			<td>RSPU500-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>14432-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>41298-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablets</td>
			<td>Quip Labs</td>
			<td>VMTAB75BX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics

O desenvolvimento de antimicrobianos é um processo caro com taxas de sucesso cada vez mais baixas, o que torna menos atraente o investimento adicional em pesquisa de descoberta de antimicrobianos. A descoberta de medicamentos antimicrobianos e a subsequente comercialização podem se tornar mais lucrativas se uma abordagem de falhar rápido e falhar barato puder ser implementada dentro dos estágios de otimização de leads, onde os pesquisadores têm maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Neste artigo, descreve-se a configuração de um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectado com Staphylococcus aureus, que é simples, econômico, de alto rendimento e reprodutível. A fisiologia bacteriana no modelo imita que durante a infecção como proliferação bacteriana é dependente da capacidade do patógeno de danificar o tecido. O estabelecimento da infecção da ferida é verificado por um aumento na contagem bacteriana viável em comparação com o inóculo. Este modelo pode ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes no estágio de otimização de chumbo. Pode-se argumentar que a disponibilidade desse modelo fornecerá aos pesquisadores que desenvolvem antimicrobianos um modelo de falha rápida e falha barata, o que ajudará a aumentar as taxas de sucesso em testes subsequentes com animais. O modelo também facilitará a redução e o refinamento do uso de animais para pesquisa e, em última análise, permitirá uma tradução mais rápida e econômica de novos antimicrobianos para infecções de pele e tecidos moles para a clínica.

A identificação de uma via para esterilizar a pele antes da configuração do modelo de infecção da ferida foi um desafio. O desafio estava em esterilizar a pele sem danificar as diferentes camadas da pele, que podem então ter consequências não intencionais no resultado da infecção. Para identificar um regime de esterilização adequado, diferentes tratamentos foram tentados por diferentes períodos de tempo, conforme descrito na Tabela 1. A contaminação foi registrada como o desenvolvimento d...

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A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

O protocolo descreve um método passo-a-passo para configurar um modelo de pele ferida ovina ex vivo infectada com Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimento simula melhor infecções in vivo em comparação com técnicas convencionais de microbiologia e apresenta aos pesquisadores uma plataforma fisiologicamente relevante para testar a eficácia de antimicrobianos emergentes.

Um novo modelo de ferida cutânea de ovino ex vivo de alto rendimento para testar antibióticos emergentes

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Esse modelo permitirá que os pesquisadores nos estágios pré-clínicos críticos determinem com mais precisão a eficácia antimicrobiana de novas formulações e dê aos pesquisadores maior controle sobre o design e a formulação de medicamentos. Este modelo permite resultados reprodutíveis rápidos em um ambiente de ferida representativo. Reduz a necessidade de animais criados especificamente e facilita a tradução mais rápida de antimicrobianos tópicos para infecções de feridas para a clínica.Os principais desafios são a contaminação e a destreza. Uma técnica asséptica rigorosa e paciência com o processamento de tecidos são essenciais; a remoção precisa e proposital do retalho é necessária para o sucesso deste método. Comece com a desinfecção do fórceps, expondo-os à esterilização por calor seco a 200 graus Celsius por uma hora.Autoclave todos os artigos de vidro a 121 graus Celsius por 15 minutos antes do uso. Desinfete a secção da testa da lâmpada derramando aproximadamente 100 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM na área da amostra. Raspe a seção da testa usando cortadores elétricos, seguido de uma lavagem com 200 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM.Limpe a área usando etanol e um rolo azul e cubra a área da amostra com creme de depilação. Após 35 minutos, raspe suavemente o creme de depilação usando uma ferramenta de raspagem e avalie a área da amostra. Repita o processo de depilação se uma quantidade significativa de pelos permanecer.Enxaguar a área de amostra limpa com 200 mililitros de solução de dióxido de cloro seguida de etanol e um rolo azul. Use um soco de biópsia estéril de oito milímetros para cortar uma amostra de pele de oito milímetros da área preparada. Em seguida, remova a amostra usando pinça estéril e bisturi de lâmina número 15, garantindo que toda a gordura cutânea seja removida.Coloque as amostras em um frasco estéril de 0,5 litro cheio de PBS estéril. Em seguida, transfira-os para tubos estéreis de 50 mililitros cheios de 50 mililitros de solução de dióxido de cloro de 200 PPM. Inverta o tubo duas vezes e deixe-o esterilizar por 30 minutos.Transfira as amostras para um tubo de 50 mililitros preenchido com 40 mililitros de PBS estéril. Após a lavagem do PBS, coloque cada amostra de pele em um poço separado de uma placa de 24 poços. Adicione 350 microlitros do meio pré-aquecido em um poço, mantendo a amostra na interface ar-líquido.Sele as placas de 24 poços com uma vedação de placa permeável a gás antes de colocar a placa para incubação em uma incubadora de tecido umidificado a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, retirar o meio de cultura e enxaguar as amostras em 500 microlitros de PBS estéril. Remova os antibióticos residuais da amostra, tratando-os com meios livres de antibióticos a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius por 24 horas.Se a turbidez ou infecção fúngica se desenvolver no meio livre de antibióticos, descarte a amostra. Em seguida, prepare um tubo de 50 mililitros com 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril. Em seguida, transfira várias colônias de Staphylococcus aureus de uma placa de ágar fresco de S.aureus para o caldo e incube o tubo a 37 graus Celsius e 150 RPM por 18 horas.Depois de centrifugar os tubos a 4.000 G por três minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de PBS estéril. Repita a lavagem PBS duas vezes antes de ajustar o inóculo para a densidade óptica de 0,6 a comprimentos de onda de 600 nanômetros usando PBS estéril. Confirme a carga de inóculo por uma contagem manual de placas viáveis.Para infectar a amostra de pele, prepare uma placa fresca de 24 poços com 400 microlitros de meio livre de antibióticos pré-aquecidos e adicione as inserções de 24 poços usando pinça estéril. Remova a mídia das amostras de pele. Lave-os com 500 microlitros de PBS estéril e remova a lavagem.Use pinças estéreis para segurar suavemente a amostra no fundo do poço. Use uma biópsia de punção de quatro milímetros para perfurar a amostra de pele a uma profundidade aproximada de um a dois milímetros e fazer um retalho central da ferida. Em seguida, use um bisturi de lâmina número 15 e pinças de tecido Allis de dentes estéreis para remover a camada superior do retalho da ferida.Uma vez que todas as amostras tenham sido feridas, transfira-as para as 24 inserções de poço usando pinça estéril. Pipetar 15 microlitros do inóculo bacteriano para o leito da ferida antes de incubar por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de tecido umidificada. Para períodos de incubação mais longos, remova o meio, substitua-o por um meio fresco a cada 24 horas e incube as placas nas mesmas condições.Para determinar a carga bacteriana, remova o meio do fundo dos poços. E usando pinça estéril, transfira cada amostra para um tubo separado de 50 mililitros preenchido com um mililitro de PBS estéril. Em seguida, retire as bactérias da superfície do leito da ferida homogeneizando a superfície da amostra com um homogeneizador de ponta fina.Certifique-se de que o leito da ferida esteja em contato direto com a ponta do homogeneizador. Uma vez que todas as amostras são processadas, vórtice cada amostra antes de transferir 20 microlitros de homogeneizado para o poço correspondente de uma placa de 96 poços contendo 180 microlitros de PBS estéril. Diluir serialmente cada homogeneizado da amostra para 1 vezes 10 para o negativo 7, e pipetar 10 microlitros do homogeneizado diluído para uma placa de ágar de soja tríptica em triplicado.Incubar a placa de ágar de soja tríptica a 37 graus Celsius e, após 18 horas, contar o número de colônias para determinar as unidades formadoras de colônias ou UFC para cada amostra. Um regime apropriado de esterilização da pele foi identificado usando diferentes tratamentos por diferentes períodos de tempo. A integridade tecidual foi monitorada por histologia, seguida de coloração com hematoxilina e eosina imediatamente após o tratamento.Um tratamento de 30 minutos com dióxido de cloro foi o tratamento mais eficaz, com esterilização reprodutível do tecido cutâneo, preservando a integridade tecidual. Um filme branco no leito da ferida foi evidente no tecido 48 horas após a infecção. Embora o modelo de arranhões tenha abrigado um maior número médio de UFCs após 24 horas, a técnica de retirada do retalho produziu resultados mais consistentes.Após 48 horas, aproximadamente 100 vezes mais UFCs bacterianas foram recuperadas do tecido ferido em comparação com o inóculo, indicando uma infecção bem-sucedida. Seções histológicas coradas de Gram do tecido infectado indicaram a presença de células de S.aureus no leito da ferida, que estava ausente nas seções de tecido não infectado. Após este procedimento, pode-se realizar imuno-histoquímica para estudar a resposta tecidual, coloração de grama modificada para visualizar a localização bacteriana e contagens de placas viáveis após a exposição antimicrobiana para testar a eficácia antimicrobiana.Para os pesquisadores que desenvolvem novos antimicrobianos, esse modelo proporcionará maior controle da otimização do chumbo, reduzirá a dependência de testes em animais caros e rigidamente regulamentados e permitirá a rápida tradução de antimicrobianos para a clínica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

Imunologia e Infecção

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Um romance em Vitro ferida cura ensaio para avaliar a migração celular

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Avaliação da Cicatrização aguda de Feridas utilizando o Implante de Esponja de Álcool Subcutâneo Subcutâneo Dorsal e Modelos de Ferida de Cauda Excisional.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Estabelecendo um modelo de córnea porcina ex vivo para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...