Name: a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

Författarna vill tacka EPSRC (EP/R513313/1) för finansieringen. Författarna vill också tacka R.B Elliot och Son Abattoir i Calow, Chesterfield, för att ha tillhandahållit lammhuvuden och för att vara så tillmötesgående i de tidiga stadierna av projektet, Kasia Emery för hennes stöd under hela utvecklingen av detta protokoll och Fiona Wright från institutionen för infektion, immunitet och hjärt-kärlsjukdom vid University of Sheffield för att ha bearbetat histologiproverna och varit så otroligt hjälpsamma under hela detta projekt.

Lammhuvuden från R.B Elliott och Son Abattoir användes som källa till hudprover i detta projekt. Alla lamm slaktades för konsumtion som mat. Istället för att kasta huvudena återanvändes dessa för forskning. Etiskt godkännande krävdes inte eftersom vävnaden kom från avfall som kasserats från slakterier.
1. Sterilisering
<ol><li>Desinficera tången före uppsamling av huvudena genom att ta rena tångar och utföra sterilisering av torr värme i en ugn vid 200 °C...

<ol>
	<li>Claeys, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+published+risk+factors+for+methicillin-resistant+S.+aureus+in+acute+bacterial+skin+and+skin+structure+infections.">Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).</li><li>Rahim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contribution+in+chronicity+of+wounds.">Bacterial contribution in chronicity of wounds.</a> Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).</li><li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+in+evaluating+management+of+unhealed+surgical+wounds+in+the+community+in+clinical+practice+in+the+UK:+A+cohort+study.">Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study.</a> BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).</li><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+A+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Wilcox, M. H., Dryden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+epidemiology+of+healthcare-acquired+bacterial+infections:+Focus+on+complicated+skin+and+skin+structure+infections.">Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).</li><li>Han, G., Ceilley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+healing:+A+review+of+current+management+and+treatments.">Chronic wound healing: A review of current management and treatments.</a> Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).</li><li>Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+tolerance+and+the+significance+of+persister+cells+in+recalcitrant+chronic+wound+biofilms.">Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dheman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+antibacterial+drug+development+trends+in+the+United+States,+1980-2019.">An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019.</a> Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).</li><li>MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+tissue-engineered+skin+and+oral+mucosa+for+clinical+and+experimental+use.">Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+ex+vivo+porcine+skin+explant+model+for+the+assessment+of+mature+bacterial+biofilms.">Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+infection.">Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection.</a> Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+murine+model+for+delayed+wound+healing+using+a+biological+wound+dressing+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).</li><li>Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+tissues+for+research:+What+investigators+need+to+know.">The use of human tissues for research: What investigators need to know.</a> Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).</li><li>Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+human+skin+model+for+studying+skin+barrier+repair.">An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair.</a> Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).</li><li>Torres, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+murine+skin+model+for+B.+burgdorferi+biofilm.">Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm.</a> Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).</li><li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+diabetic+(db/db)+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge:+A+model+for+the+study+of+chronic+wounds.">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).</li><li>Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcal+biofilms+impair+wound+healing+by+delaying+reepithelialization+in+a+murine+cutaneous+wound+model.">Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).</li><li>Tr&#248;strup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB/c+mice+in+a+novel+chronic+wound+model.">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li><li>Thompson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+gallium+citrate+formulations+against+a+multidrug-resistant+strain+of+Klebsiella+pneumoniae+in+a+murine+wound+model+of+infection.">Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).</li><li>Maboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+skin+explant+model+to+study+anaerobic+bacterial+infection.">A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).</li><li>Macneil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin.">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li><li>Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karl&#233;n, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+preclinical+antibacterial+pipeline.">The global preclinical antibacterial pipeline.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).</li><li>Miethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+sustainable+discovery+and+development+of+new+antibiotics.">Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics.</a> Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).</li><li>Guedes, G. M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+situ+model+of+biofilm-associated+wounds:+Providing+a+host-like+environment+for+the+study+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).</li><li>Johnson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+the+activity+of+chlorhexidine+for+decolonization+of+Candida+auris+from+porcine+skin.">Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin.</a> Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).</li><li>Horton, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+auris+Forms+High-Burden+Biofilms+in+Skin+Niche+Conditions+and+on+Porcine+Skin.">Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin.</a> mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).</li><li>Ashrafi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+biofilm+formation+on+human+skin+wound+models+and+demonstration+of+clinically+translatable+bacteria-specific+volatile+signatures.">Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures.</a> Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).</li><li>Brackman, G., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+biofilm+wound+models+and+their+application.">In vitro and in vivo biofilm wound models and their application.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).</li><li>Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Models+of+Biofilm+Infection.">In Vivo Models of Biofilm Infection.</a> Biofilm Infections. , 267-290 (2011).</li><li>Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sheep+model+to+investigate+the+role+of+fungal+biofilms+in+sinusitis:+Fungal+and+bacterial+synergy.">A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy.</a> International Forum of Allergy &amp; Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).</li><li>Williams, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+model+of+biofilm+implant-related+osteomyelitis+to+test+combination+biomaterials+using+biofilms+as+initial+inocula.">Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).</li><li>Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+sheep+models:+From+asthma+to+vaccines.">Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines.</a> Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).</li><li>Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+replacement+skin:+The+crossroads+of+biomaterials,+wound+healing,+embryonic+development,+stem+cells+and+regeneration.">Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration.</a> Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).</li><li>Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogenous+skin+fibroblast+transplantation+enhances+excisional+wound+healing+following+alloxan+diabetes+in+sheep,+a+randomized+controlled+trial.">Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial.</a> International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).</li><li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+mesenchymal+stem+cells+improve+the+wound+healing+process+of+sheep+skin.">Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin.</a> BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).</li><li>Roberts, C. D., Windsor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+pain+management+solutions+in+animals+may+provide+improved+wound+pain+reduction+during+debridement+in+humans:+An+opinion+informed+by+veterinary+literature.">Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature.</a> International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).</li><li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model:+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair.">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li><li>Olkowska, E., Gr&#382;ini&#263;, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates.">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909 (2022).</li><li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model.">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li></ol>

Utvecklingen av antimikrobiella medel är en viktig men dyr satsning som beräknas kosta cirka 1 miljard dollar och ta cirka 15 år att slutföra. Över 90% av antimikrobiella läkemedelsupptäckter och prekliniska studier av antimikrobiell läkemedelseffekt utförs av akademiska forskare och små till medelstora företag med vanligtvis mindre än 50 anställda22. Dessa team är mycket ekonomiskt begränsade, vilket gör misslyckandet med blymolekyler i senare skeden av translationell forskning ka...

Hudinfektioner är en viktig global fråga, med stora ekonomiska kostnader för vårdgivare runt om i världen. Utvecklingen av multidrogresistens och biofilmbildning av patogener spelar en nyckelroll i förekomsten av icke-helande sår 1,2,3,4. Som ett resultat av detta är hud- och mjukvävnadsinfektioner en av de vanligaste orsakerna till förlängd sjukhusvistelse och efterföljande återinläggning5. Förseningar i sårläkning är kostsamma för både patienten och vårdgivare, med vissa uppskattningar som tyder på att cirka 6,5 miljoner patienter drabbas årligen i USA. I Storbritannien leder hudinfektioner och tillhörande komplikationer till cirka 75 000 dödsfall årligen 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) är en formidabel sårpatogen som ofta isoleras från patientsår 2,7. Graden av uppkomst av multiresistans ökade drastiskt under 2000-talet. Under denna tid var cirka 60% av akuta bakteriella hud- och hudstrukturinfektioner kulturpositiva för meticillinresistenta S. aureus1. Det ökande antalet multiresistenta stammar bland stafylokocker, och faktiskt andra patogener, under de senaste 2 decennierna indikerar ett brådskande behov av snabb utveckling av antibiotika med nya verkningssätt som kan övervinna resistens.
Men sedan början av 2000-talet har antibiotikaupptäcktsprogram dominerats av längre utvecklingstider och låga framgångsgrader, med endast 17% av nya antibiotika som går in i kliniska prövningar i USA som uppnår marknadsgodkännande8. Detta tyder på en skillnad mellan resultat från in vitro-testning av nya antibiotika och deras kliniska resultat. Det kan hävdas att denna skillnad till stor del beror på skillnader i bakteriell fysiologi vid infektioner in vivo och under konventionella mikrobiologiska metoder vid testning av antibiotikas effektivitet i de prekliniska in vitro-stadierna. Därför behövs nya laboratoriemetoder som är mer representativa för bakteriell fysiologi under infektion för att förbättra framgångsgraden i antibiotikaupptäcktsprogram.
Nuvarande metoder för att studera hudinfektioner inkluderar studier på levande djur (t.ex. möss), ex vivo-hudmodeller (t.ex. svin) och 3D-vävnadskonstruerade hudmodeller (t.ex. människa)9,10,11,12. Studier på levande djur är strikt reglerade och har relativt låg genomströmning. I djurmodeller orsakar sår och infektion betydande lidande för djuren och väcker etiska problem. Mänskliga hudmodeller, ex vivo eller vävnadskonstruerade, kräver etiskt godkännande, efterlevnad av lokal och global lagstiftning (lagen om mänsklig vävnad, Helsingforsdeklarationen), och det finns svårigheter att skaffa vävnader, med vissa förfrågningar som tar år att uppfylla13,14. Båda modelltyperna är arbetsintensiva och kräver betydande expertis för att säkerställa experimentell framgång. Vissa nuvarande ex vivo-hudinfektionsmodeller kräver förinokulerade skivor och tillsatser för sårbädden för att möjliggöra infektion; Även om dessa modeller är otroligt användbara finns det begränsningar i infektionsprocessen eftersom tillsatser begränsar användningen av sårbädden som näringskälla10,15,16,17. Modellen som beskrivs i denna studie använder inga tillsatser till sårbädden, vilket säkerställer att infektionspatologin och livskraftiga cellantal är ett resultat av direkt utnyttjande av sårbädden som den enda näringskällan.
Med tanke på behovet av nya laboratoriemetoder har en ny ex vivo-modell med hög genomströmning av hudinfektioner utvecklats för att utvärdera effekten av nya antibiotika. Hudinfektionsstudier står inför många utmaningar-höga kostnader, etiska problem och modeller som inte visar en fullständig bild20,21. Ex vivo-modeller och 3D-explantmodeller möjliggör bättre visualisering av sjukdomsprocessen och den inverkan behandlingar kan ha från en mer kliniskt relevant modell. Här beskrivs installationen av en ny fårhudsmodell, som är enkel, reproducerbar och kliniskt relevant och har hög genomströmning. Fårskinn valdes eftersom får är ett av de stora däggdjur som vanligtvis används för att modellera svar på infektioner in vivo. Dessutom är de lätt tillgängliga från slakterier, vilket säkerställer en stadig tillgång på hud för forskning, och deras slaktkroppar skållas inte, vilket garanterar god vävnadskvalitet. Denna studie använde S. aureus som exempelpatogen; Modellen fungerar dock bra med andra mikroorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Companion Plate</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Williams Medical</td>
			<td>D7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B solution, sterile</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colour Pro Style Cordless Hair Clipper</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9639-2117X</td>
			<td>Hair Clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>458600-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212&#160;</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, Handheld</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 220, plastic blending cones</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15585819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert Individual 24 well 0.4um membrane</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (MK media)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, cell culture Costar 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10687551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS&#160;</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate seals</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ESI-B-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed Allis Tissue Forceps</td>
			<td>Rocialle</td>
			<td>RSPU500-322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>14432-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>41298-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablets</td>
			<td>Quip Labs</td>
			<td>VMTAB75BX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel high-throughput ex vivo ovine skin wound model for testing emerging antibiotics

Utvecklingen av antimikrobiella medel är en dyr process med allt lägre framgångsgrad, vilket gör ytterligare investeringar i forskning om upptäckt av antimikrobiella medel mindre attraktiva. Antimikrobiell läkemedelsupptäckt och efterföljande kommersialisering kan göras mer lukrativ om en misslyckad-snabb-och-misslyckas-billig strategi kan implementeras inom de ledande optimeringsstadierna där forskare har större kontroll över läkemedelsdesign och formulering. I den här artikeln beskrivs installationen av en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus, som är enkel, kostnadseffektiv, hög genomströmning och reproducerbar. Bakteriefysiologin i modellen efterliknar att vid infektion som bakterieproliferation är beroende av patogenens förmåga att skada vävnaden. Upprättandet av sårinfektion verifieras genom en ökning av livskraftiga bakterieantal jämfört med inokulumet. Denna modell kan användas som en plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel i blyoptimeringsstadiet. Det kan hävdas att tillgången till denna modell kommer att ge forskare som utvecklar antimikrobiella medel en misslyckas-snabbt-och-misslyckas-billigt modell, vilket kommer att bidra till att öka framgångsgraden i efterföljande djurförsök. Modellen kommer också att underlätta minskning och förfining av djuranvändning för forskning och i slutändan möjliggöra snabbare och mer kostnadseffektiv översättning av nya antimikrobiella medel för hud- och mjukdelsinfektioner till kliniken.

Identifieringen av en väg för att sterilisera huden innan man satte upp sårinfektionsmodellen var utmanande. Utmaningen låg i att sterilisera huden utan att skada de olika hudlagren, vilket sedan kan få oavsiktliga konsekvenser i resultatet av infektionen. För att identifiera en lämplig steriliseringsregim prövades olika behandlingar under olika lång tid, som beskrivs i tabell 1. Kontaminering registrerades som utveckling av grumlighet efter 48 timmar i MK-mediet som användes för att underhål...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics at JoVE.com

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Protokollet beskriver en steg-för-steg-metod för att sätta upp en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus. Denna modell med hög genomströmning simulerar bättre infektioner in vivo jämfört med konventionella mikrobiologiska tekniker och ger forskare en fysiologiskt relevant plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel.

En ny ex vivo-sårmodell med hög genomströmning för får för testning av nya antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Denna modell kommer att göra det möjligt för forskarna i de kritiska prekliniska stadierna att mer exakt bestämma den antimikrobiella effekten av nya formuleringar och ger forskare större kontroll över läkemedelsdesign och formulering. Denna modell möjliggör snabba reproducerbara resultat i en representativ sårmiljö. Det minskar behovet av ändamålsuppfödda djur och underlättar snabbare översättning av aktuella antimikrobiella medel för sårinfektioner till kliniken.De största utmaningarna är kontaminering och fingerfärdighet. En strikt aseptisk teknik och tålamod med vävnadsbehandling är avgörande;exakt och målmedvetet borttagning av klaff behövs för att denna metod ska lyckas. Börja med desinfektion av pincett genom att utsätta dem för torr värmesterilisering vid 200 grader Celsius i en timme.Autoklavera alla glasvaror vid 121 grader Celsius i 15 minuter före användning. Desinficera lampans panndel genom att hälla cirka 100 ml 200 PPM klordioxidlösning på provområdet. Raka pannsektionen med elektriska klippare, följt av en tvätt med 200 ml 200 PPM klordioxidlösning.Torka av området med etanol och en blå rulle och täck provområdet med hårborttagningskräm. Efter 35 minuter, skrapa försiktigt bort hårborttagningskrämen med ett skrapverktyg och bedöm provområdet. Upprepa hårborttagningsprocessen om en betydande mängd hår kvarstår.Skölj det rena provområdet med 200 ml klordioxidlösning följt av etanol och en blå rulle. Använd en steril åtta millimeter biopsistans för att skära ut ett åtta millimeter hudprov från det beredda området. Ta sedan bort provet med sterila pincett och skalpell nummer 15, se till att allt kutant fett tas bort.Placera proverna i en steril 0,5 liters burk fylld med steril PBS. Överför dem sedan till sterila 50-milliliterrör fyllda med 50 ml 200 PPM klordioxidlösning. Vänd röret två gånger och låt det sterilisera i 30 minuter.Överför proverna till ett 50-ml rör fyllt med 40 ml steril PBS. Efter PBS-tvätten, placera varje hudprov i en separat brunn på en 24-brunnsplatta. Tillsätt 350 mikroliter av det förvärmda mediet i en brunn, samtidigt som provet bibehålls vid luft-vätskegränssnittet.Försegla 24-brunnsplattorna med en gasgenomsläpplig platttätning innan du placerar plattan för inkubation i en fuktad vävnadsinkubator vid 5% koldioxid och 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter inkubation, ta bort odlingsmediet och skölj proverna i 500 mikroliter steril PBS. Ta bort de återstående antibiotika från provet genom att behandla dem med antibiotikafria medier vid 5% koldioxid och 37 grader Celsius i 24 timmar.Om grumlighet eller svampinfektion utvecklas i det antibiotikafria mediet, kassera provet. Förbered sedan ett 50-ml rör med 10 ml steril tryptisk sojabuljong. Överför sedan flera Staphylococcus aureus-kolonier från en färsk agarplatta av S.aureus till buljongen och inkubera röret vid 37 grader Celsius och 150 RPM i 18 timmar.Efter centrifugering av rören vid 4 000 G i tre minuter, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml steril PBS. Upprepa PBS-tvätten två gånger innan du justerar inokulatet till 0,6 optisk densitet vid 600 nanometer våglängder med steril PBS. Bekräfta inokulumbelastningen med ett manuellt antal livskraftiga plattor.För att infektera hudprovet, förbered en ny 24-brunnsplatta med 400 mikroliter förvärmda antibiotikafria medier och tillsätt de 24 brunnsinsatserna med sterila pincett. Ta bort mediet från hudproverna. Tvätta dem med 500 mikroliter steril PBS och ta bort tvätten.Använd sterila pincett för att försiktigt hålla provet i botten av brunnen. Använd en fyra millimeters stansbiopsi för att tränga igenom hudprovet till ett grovt djup på en till två millimeter och gör en central sårflik. Använd sedan en skalpell nummer 15 och steriltandade Allis-vävnadstångar för att ta bort det övre lagret av sårfliken.När alla prover har sårats, överför dem till de 24 brunnsinsatserna med sterila pincett. Pipettera 15 mikroliter av bakterieinokulumet i sårbädden innan du inkuberar i 24 timmar vid 37 grader Celsius i en fuktad vävnadsinkubator. För längre inkubationsperioder, ta bort mediet, byt ut det med färskt media var 24: e timme och inkubera plattorna under samma förhållanden.För att bestämma bakteriebelastningen, ta bort mediet från botten av brunnarna. Och använd sterila pincett, överför varje prov till ett separat 50-milliliter rör fyllt med en milliliter steril PBS. Lossa sedan bakterierna från sårbäddens yta genom att homogenisera provytan med en finspetsad homogenisator.Se till att sårbädden är i direkt kontakt med homogenisatorns spets. När alla prover har bearbetats, virvla varje prov innan du överför 20 mikroliter homogenat till motsvarande brunn i en 96-brunnsplatta innehållande 180 mikroliter steril PBS. Späd varje provhomogenat serie till 1 gånger 10 till minus 7 och pipettera 10 mikroliter av det utspädda homogenatet på en tryptisk sojaagarplatta i tre exemplar.Inkubera tryptisk sojaagarplatta vid 37 grader Celsius och efter 18 timmar räkna antalet kolonier för att bestämma kolonibildande enheter eller CFU för varje prov. En lämplig hudsteriliseringsregim identifierades med hjälp av olika behandlingar under olika lång tid. Vävnadsintegritet övervakades av histologi, följt av färgning med hematoxylin och eosin omedelbart efter behandlingen.En 30-minuters behandling med klordioxid var den mest effektiva behandlingen, med reproducerbar sterilisering av hudvävnaden samtidigt som vävnadens integritet bevarades. En vit film i sårbädden syntes på vävnaden 48 timmar efter infektion. Även om repmodellen hade ett högre genomsnittligt antal CFU: er efter 24 timmar, gav klaffborttagningstekniken mer konsekventa resultat.Efter 48 timmar återfanns cirka 100 gånger fler bakteriella CFUs från den sårade vävnaden jämfört med inokulum, vilket indikerar en framgångsrik infektion. Gramfärgade histologisektioner av den infekterade vävnaden indikerade närvaron av S.aureus-celler i sårbädden, som var frånvarande i sektionerna av oinfekterad vävnad. Efter denna procedur kan man utföra immunhistokemi för att studera vävnadssvar, modifierad gramfläck för att visualisera bakterielokaliseringen och livskraftiga platträkningar efter antimikrobiell exponering för att testa antimikrobiell effekt.För de forskare som utvecklar nya antimikrobiella medel kommer denna modell att ge större kontroll över blyoptimering, minska beroendet av dyra och hårt reglerade djurförsök och möjliggöra snabb översättning av antimikrobiella medel till kliniken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

En 96 Väl mikrotiterplatta-baserad metod för övervakning Bildning och svampdödande resistensbestämning av Candida albicans Biofilmer

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Hög genomströmning, i realtid, med dubbla avläsning Provning av intracellulära antimikrobiell aktivitet och eukaryot cell cytotoxicitet

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

En roman In Vitro Wound Healing analys för att utvärdera cellmigration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

In Vivo Avbildning av reaktiva syreradikaler i en murin sår modell

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Bedömning av akut sårläkning med dorsala subkutan polyvinyl alkohol svamp implantation och excisional svans hud sår modeller.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Etablera en Porcine Ex Vivo Cornea-modell för att studera läkemedelsbehandlingar mot bakteriell keratit

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...