2.0K Views
•
12:57 min
•
December 9th, 2022
DOI :
December 9th, 2022
•0:14
Introduction
2:06
Extended Anti-Inflammatory Treatment
2:57
Preoperative Preparation
4:10
Intraductal Injection
7:10
Micro-CT Imaging
9:06
Image Analysis
10:03
Results
11:33
Conclusion
Transcript
Borstkanker is een veel voorkomende en dodelijke ziekte met beperkte preventiestrategieën die gepaard gaan met ernstige negatieve bijwerkingen. Om een methode met verminderde bijwerkingen te bieden, hebben we een techniek ontwikkeld voor intraductale injectie van een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing voor de ductale boom van de borstmaan van de rat die gelijktijdige in vivo beeldvorming en borstkankerpreventie mogelijk maakt. Dit bouwt voort op eerder werk bij muizen waarbij injectie rechtstreeks in de tepelopening het mogelijk maakt om borstepitheelcellen aan te pakken met minimale collaterale weefselschade.
Zowel muizen als ratten hebben borstklieren met een enkele ductale boom afkomstig van de tepelopening. Ratten zijn groter dan muizen en maken injectie van een groter volume ethanol mogelijk voor onderzoek naar ablatiesucces om de schaalbaarheid van het model te bewijzen. Een andere verfijning van deze methode is de toevoeging van ethylcellulose aan de ablatieve oplossing.
Ethylcellulose is eerder gebruikt in andere klinische benaderingen om de verspreiding van ethanol weg van het beoogde gebied te verminderen. Dit wordt bereikt door de aard van de verbinding, die ervoor zorgt dat het gel wanneer het in contact komt met vloeistof in het weefsel. Er zijn vijf belangrijke stappen betrokken bij deze methode van beeld geverifieerde borstkankerpreventie.
We moeten eerst beginnen met het oraal doseren van dieren met carprofen met behulp van sucralose gelcups die in het laboratorium zijn bereid. Deze uitgebreide ontstekingsremmende behandeling wordt pre- en postprocedure gehandhaafd. Vervolgens verwijderen we de vacht uit het gebied rond de tepels om te worden geïnjecteerd met ontharingscrème om het dier voor te bereiden op injecties.
Intraductale injecties worden vervolgens uitgevoerd met een stereoscoop die visualisatie van de tepelopening voor het inbrengen van naalden ondersteunt. Dieren worden gescand of beoordeeld door microCT of fluoroscopie na injectie om het succes van injecties te bepalen. microCT-scans kunnen vervolgens worden verwerkt om 3D-reconstructies van de geïnjecteerde borstkanaalboom te maken voor verdere analyse van succesvolle vulling.
Stock carprofen wordt eerst verdund in PVS tot de vereiste concentratie. Steriele voedselkleurstof kan aan het mengsel worden toegevoegd om de volledige menging van het geneesmiddel in de sucralose van de beker beter te bevestigen. Kopjes worden vervolgens gedurende 15 minuten verwarmd in een waterbad op 60 graden Celsius.
Het drogen van de bekers bij het verwijderen en het reinigen van het deksel van de beker met 70% ethanol vermindert het risico op besmetting. Carprofen-oplossing kan rechtstreeks in de beker worden geïnjecteerd met behulp van een spuit om het deksel te doorboren. In dit geval moeten we 500 microliter injecteren voor het gewenste resultaat.
Sluit het gat af met een sticker voordat u de beker gedurende 15 seconden schudt en vervolgens nog eens 15 seconden vortext. Homogene menging kan worden beoordeeld door te zoeken naar klonten donkerblauw. Kopjes kunnen dan worden gekoeld totdat ze nodig zijn.
Dieren moeten twee tot drie dagen voordat injecties moeten plaatsvinden, worden voorbereid. Anesthetiseer het dier met behulp van inhalatie-isofluraan. Breng verdoofde rat over naar een neuskegel op een verwarmend pad.
Breng oogsmeermiddel aan op de rat terwijl u zich bij de neuskegel bevindt en plaats het dier vervolgens op zijn rug. Ontharingscrème kan worden aangebracht op het gebied van de tepels dat u van plan bent te injecteren met een applicator met katoenen punt. Snellere loslating van de vacht kan worden bereikt door de applicator op en neer over de huid van het dier in het gewenste gebied te wrijven.
Het is belangrijk om de crème zo kort mogelijk op de rat te laten zitten om te voorkomen dat de huid verbrandt. Ratten zijn zelfs gevoeliger dan muizen voor deze procedure. Gebruik na 10 tot 30 seconden aanbrengen warm water op gaas om de crème volledig te verwijderen.
Gebruik drie tot vier spoelingen om volledige verwijdering te garanderen voordat u de huid droogt met schoon gaas. Bevestig een goed zicht en toegang tot de tepels in de gebieden van vachtverwijdering. Herhaal indien nodig de ontharingsprocedure.
Plaats de rat in een schone herstelkooi op een opwarmpad om te herstellen van de anesthesie. Geef na herstel één carprofenbeker aan voorbereide ratten in hun thuiskooi. U begint met het verdoven van het dier met behulp van inhalatie-isofluraanane-anesthesie en verplaatst de rat naar een neuskegel zodra deze volledig is geïnduceerd.
Oogsmeermiddel moet worden aangebracht voordat het dier op zijn rug wordt geplaatst voor injecties. Het kan nuttig zijn om de benen in de buurt van de tepels die worden geïnjecteerd, maar niet nodig zijn, af te plakken. Nadat u de spuit met het gewenste volume injectieoplossing hebt voorbereid, bereidt u de tepel voor door eventuele zichtbare dode huid te verwijderen met een tang met fijne punt.
Het meest voorkomende punt van zorg is de tepelopening zelf. Ratten hebben vaak een plug die uit de opening steekt. Het verwijderen van deze plug kan helpen bij een betere cannulatie.
Met de schuine kant van de naald zichtbaar, steekt u de naald in de punt van de tepel met hulp van een fijne tang. Zorg ervoor dat u het pad van de tepelopening volgt. Rattentepels hebben de neiging om meer vet rond de opening te hebben, waardoor het gemakkelijker is om in dit vet te prikken en ten onrechte te geloven dat je cannulatie hebt bereikt als gevolg van de vooruitgang van de naald.
Zodra de naaldafschuin volledig is omgeven door de tepel, begint u langzaam met het injecteren van de oplossing. De gewenste snelheid is ongeveer 100 microliter per minuut bij ratten. Vermijd sneller injecteren om mogelijke schade aan de ductale boom te voorkomen.
Wacht na volledige injectie 30 seconden voordat u de naald uit de tepel verwijdert met behulp van de tang. Dit vermindert de kans op lekkage uit de tepel. Als er lekkage optreedt, gebruik dan bevochtigd gaas of een ethanoldoekje om de oplossing schoon te maken.
Contrast en gemorste oplossing kunnen verkregen beelden vervormen. Hier zien we een vergrote video van de injectiesequentie die zojuist werd weergegeven. Merk op dat de ademhaling van het dier het moeilijk maakt om de tepel in een enkel brandpuntsvlak te houden.
Dit kan injectie moeilijker maken omdat de tepel niet op een constante locatie blijft. Dit probleem wordt verergerd door de nabijheid van de ribbenkast en de bovenste drie klierparen. De plug in de tepelopening is nu verwijderd voor een betere cannulatie.
De naald kan nu schuin worden georiënteerd om met behulp van de tang in de tepel te worden geschoven. Zodra de schuine kant volledig is ingebracht, kan de injectie beginnen. Als u goed naar de linkerkant van de tepel kijkt, kunt u een toename van de blauwe tint opmerken waarbij de injectieoplossing enigszins zichtbaar is en zich door de ductale boom verspreidt.
Dit is veel minder zichtbaar bij de rat door een dikkere huid. Hier kunnen we zien dat de naald 30 seconden nadat de injectie is voltooid, wordt verwijderd en dat de resulterende oplossing uit de tepel morst. De extra oplossing wordt schoongemaakt, waardoor het gebied kan worden beoordeeld waar we geen trauma aan de tepel of doming van het gebied zien, wat zou wijzen op een vetkusseninjectie.
Als u een oplossing met ethanol injecteert, moet ervoor worden gezorgd dat alcoholintoxicatie wordt voorkomen. Dit vereist weten hoeveel ethanol in één sessie kan worden geïnjecteerd en sucrose-bevattende oplossing IP toedienen tijdens de procedure om de effecten tegen te gaan. Na injectie kunnen dieren worden teruggevonden in een schone kooi op een verwarmingskussen of worden verplaatst naar de microCT voor beeldvorming van het injectiesucces.
Nadat u het geïnjecteerde dier naar het microCT-instrument hebt verplaatst, gaat u door met het toedienen van isofluraan om de anesthesie tijdens de beeldvorming te behouden. De grotere omvang van de rat vereist extra positiemanipulatie om een goed beeld te bereiken. Het rechttrekken van de wervelkolom voordat de benen in de buurt van de te worden afgebeelde site worden afgeplakt, is nuttig bij het genereren van consistente afbeeldingen.
Het tapen van benen in een gestrekte positie kan voorkomen dat botten het brandpunt van het beeld worden. We hebben ook ontdekt dat het afplakken over de buik van de rat kan helpen bij het verminderen van de ademhaling voor de onderste klieren. Verschillende scanparameters zijn acceptabel voor visualisatie van de ductale behandeling.
Bij het selecteren van parameters moet echter altijd rekening worden gehouden met de stralingsdosis. De stralingsdosis die uit deze scans voortvloeit, mag de stralingslimieten voor een bepaalde stam ratten niet overschrijden. Fluoroscopische analyse, in plaats van beeldacquisitie, kan de totale stralingsbelasting aanzienlijk verminderen.
Zodra alle scans of beoordelingen zijn gemaakt, kan het dier worden teruggebracht naar een schone herstelkooi op een opwarmpad. Het dier moet worden gecontroleerd totdat het volledig is hersteld en teruggebracht naar de thuiskooi. Carprofen cups moeten worden verstrekt tot ten minste zeven dagen na de injectie.
De software op het microCT-instrument dat we gebruiken, maakt het mogelijk om snelle uitvoeringen te maken om het succes van injectie te beoordelen zonder formele analyse. Deze functie heeft een eenvoudige contrastschuifregelaar die een redelijke signaal-ruisonderdrukking mogelijk maakt. De belangrijkste fout in deze uitvoeringen is dat het hele beeld tegelijkertijd moet worden gedrempeld.
Hierdoor kunnen heldere signalen die duidelijk geen deel uitmaken van de ductale boom, zoals ijzer in het dieet, in beeld blijven. In sommige gevallen is het ware signaal zoals hier te zien zo zwak als de achtergrond en kan het gemakkelijk uit het beeld worden gedrempeld. Betere formele weergaven kunnen worden gemaakt met behulp van meer geavanceerde analysesoftware die segmentatie van het interessegebied mogelijk maakt.
Het is het beste om het borstvetkussen te segmenteren voor verdere beeldverwerking om de beste weergave van de geïnjecteerde ductale boom te krijgen. De donkere rand van het borstvetkussen kan over de volledige dikte van het dier worden getraceerd om deze segmentatie te bereiken. Het traceren van elke derde plak en het verspreiden van het object is voldoende om het geheel van het kanaal in onze ervaring vast te leggen.
Op dit punt is het mogelijk om de weergave te drempelen met behulp van een bepaalde woede om alleen het contrast in het borstvetkussen weer te geven. Dit moet de oplossing in de ductale boom omvatten, evenals eventuele lekkage in de directe omgeving. Tantaaloxide-oplossingen worden over het algemeen goed weergegeven in een bereik van 300 tot 3000 HU. Verdere analyse kan worden gevormd zodra u een reconstructie van de ductale boom hebt gemaakt.
Als longitudinale beeldvorming niet gewenst is, kunnen beelden met een hogere resolutie worden verkregen die de complexe architectuur van de ductale boom beter vastleggen. Verschillen tussen dieren kunnen injectie meer of minder moeilijk maken. We kunnen niet spreken over stamvariabiliteit omdat we momenteel uitsluitend met Sprague Dawley-ratten werken.
Sommige dieren hebben tepels met lage profielen, zoals degene die hier is afgebeeld, waardoor het moeilijk is om te manipuleren en succesvolle cannulatie te bereiken. Anderen zullen tepels hebben met een hoger profiel, zoals degene die hier wordt getoond, die meer vatbaar zijn voor cannulatie. Een succesvol gecannuleerde tepel is hier afgebeeld.
Moeite met cannuleren kan resulteren in trauma aan de tepel zoals hier getoond. Het verkrijgen van microCT-beelden onmiddellijk na de injectie kan onderzoekers beter informeren over het succes van een injectie en helpen bij het identificeren van vuleigenschappen van bepaalde oplossingen. Hier zien we verschillende aspecten van de buikklieren van dezelfde rat geïnjecteerd met hetzelfde volume van een ablatieve oplossing die 70% ethanol bevat met contrast geleverd door 100 millimoltaaloxide.
De oplossing die in de bovenste klier werd gebruikt, bevatte ook 1% ethylcellulose. We zien muurachtige structuren aan de uiteinden van de kanaaltakken. Dit zijn terminale eindknoppen gevuld met de oplossing en niet overlopend.
In de onderste rij zien we minder gedefinieerde ductale uiteinden die wijzen op het ontsnappen van de oplossing uit de ductale boom. Dit, samen met een beperktere nevenschade bij histologisch onderzoek. lijkt te wijzen op een betere retentie van oplossingen die ethylcellulose bevatten aan de ductale boom.
Deze methode biedt een stap naar schaalbaarheid van een minder invasieve methode van borstkankerpreventie om een alternatief te bieden voor profylactische mastectomie. Succesvolle epitheliale ablatie in een groter knaagdiermodel is aangetoond met minimale bijwerkingen voor het dier. Toevoeging van ethylcellulose aan de ablatieve oplossing zorgt voor een betere retentie van de oplossing op het injectiegebied, wat resulteert in verminderde nevenschade.
Het nieuwe gebruik van oplossingen die klinisch zijn bewezen en het extra vermogen om het succes van de levering te visualiseren met gemeenschappelijke beeldvormingsmodaliteiten, maakt een kant-en-klare vertaling naar de kliniek mogelijk.
Een procedure voor de levering van een chemische ablatieve oplossing aan de borstkanaalboom van de rat voor beeldgeleide preventieve behandeling van borstkanker wordt beschreven. Borstepitheelcellen kunnen worden gericht met minimale collaterale weefselschade door cannulatie rechtstreeks in de tepelopening en intraductale infusie van een 70% op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved