Dette er et hjernetumorresektionsparadigme, der er meget nødvendigt i præklinisk forskning i terapi til hjernetumorer. Det tillader en standardiseret resektion gennem en minimalt invasiv tilgang, samtidig med at den også er koblet til et automatiseret vævsopbevaringssystem. Denne protokol gør det muligt for dyr at overleve efter operationen og hjælper dermed med at forstå ændringerne i sygdomstilstand efter behandling i samme dyr.
Dette hjælper med sekventielle og time-lapse terapeutiske applikationer. Ved hjælp af denne teknik kan vi evaluere sygdommens biologi og planlægge mulig efterfølgende håndtering. Dette har betydelige implikationer og muligheder inden for lægemiddelopdagelse og nye terapier.
Begreberne standardiseret resektion, en minimalt invasiv tilgang og automatiseret vævsbevarelse kan udvides til andre typer tumorer i forskellige organsystemer, såsom levertumorer og hoved- og halskræft. Protokollen er enkel, og systemet er brugervenligt. Det er bedst at læse den offentliggjorte protokol, som indeholder alle de nødvendige trin og fejlfinding.
Begynd eksperimentet med at vurdere musen til sedation ved at klemme tåen. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at undgå tørhed i hornhinden. Placer derefter musen på en stereotaktisk ramme.
Fjern hæfteklammer fra den forrige operation og desinficer huden med skiftende cyklusser af en chlorhexidin- eller betainbaseret skrubbe og alkohol. Opret derefter et en centimeter langsgående midterlinjesnit langs det tidligere kirurgiske ar ved hjælp af en steril skalpel. Fastgør MIRS-håndstykket til den stereotaktiske arm gennem sceneadapteren.
For at konfigurere MIRS-maskinen skal du indsætte netledningssættet på bagpanelet i netledningsbeholderen. Tænd eller sluk for strømmen til systemet ved at skifte mellem nul og et. Indsæt den ene ende af nitrogenslangen i hanbeslaget på konsolens bagpanel.
Drej forbindelsesmøtrikken med uret for at stramme den. Sørg for, at forsyningstrykket ikke overstiger 100 PSIG, og fastgør slangen til nitrogentilførslen. Forsegl låget på vakuumporten for at undgå lækage.
Kontroller, at aspirationsknappen på forsiden af konsollen er indstillet til 100, at der ikke er lækage i aspirationssystemet, og at nitrogenindgangsforsyningstrykket er korrekt. Indsæt det grå fodpedalstik i den grå beholder, indtil det klikker. På samme måde skal du indsætte det blå håndstykkestik i dets blå beholder.
Prime hvert håndstykke ved at aspirere steril væske ind i åbningen gennem slangen og håndstykket og derefter ind i beholderen for at sikre, at indersiden af slangen og håndstykket smøres. Vælg aspirationstilstand på konsollens frontpanel, og start ved hjælp af fodpedalen. Indsæt 23-G MIRS-kanylen i burrhullet til en dybde på 2,5 millimeter.
Start resektionsprocessen ved at trykke på fodpedalen, der er tilsluttet kanylen. Udfør fulde cyklusser af resektion ved hjælp af kontrolknappen i håndstykket. Efter resektionsprocessen trækkes 23-gauge MIRS-kanylen ud og tilsættes fem milliliter 1X PBS for at skylle slangen og løsne eventuelt resterende affald.
Luk derefter såret med en hæftemaskine og fjern musen fra den stereotaktiske ramme. Sæt musen tilbage på varmepuden for at komme sig efter anæstesi, før du placerer den tilbage i buret. Efter eksperimentet skal du rense kanylen med afkølede medier og luft for at skubbe alt det resekterede væv tilbage til opsamlingsbeholderen.
Fjern opsamlingsbeholderen fra systemet, og placer en hætte. Placer derefter kanylens distale spids i 3% hydrogenperoxid og påfør sugning for at fylde sugeledningen tilbage til sugeopsamlingsbeholderen. Lad det stå i 60 til 90 sekunder og pulser intermitterende luft og medier for at skylle det.
Tumorprøven nedsænkes i en vævskulturskål indeholdende RBC-lysismedium i fem minutter ved stuetemperatur. Placer derefter et 70 mikron filter på et 50 ml konisk rør og brug et sprøjtestempel til at føre tumorprøven gennem filteret. Med en overførselspipette skal du bruge RPMI 1640-mediet til at føre cellerne og enhver vævsmasse gennem filteret.
Centrifuge ved 428 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Supernatanten kasseres, og hver prøve resuspenderes i fem milliliter forberedt RPMI 1640-medium. Prøverne anbringes i en shaker-inkubator i 20 minutter ved 200 o / min ved 37 grader Celsius.
Efter inkubation centrifugeres prøverne ved 428 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og kasseres supernatanten. Filtrer enkeltceller gennem en 70 mikron cellesi og centrifuge ved 274 gange G i tre minutter ved fire grader Celsius. Udfør cellelevedygtighedsanalyse med trypanblå og et hæmocytometer.
Kirurgisk resektion hos mus ved hjælp af MIRS forårsagede et signifikant fald i tumorbyrden som angivet ved reduktionen i det gennemsnitlige baseline bioluminescerende signal for grupper med både stor og lille tumorbyrde. Sammenlignet med MR-billederne af tumorer før resektion kan resektionshulrummet identificeres på post-resektionsscanningerne som et stort, rundt hypointenst område på tumorpodningsstedet. I H&E-farvede sektioner blev der observeret et klart cirkulært resektionshulrum med en kant af blodprodukter, betændelse og resterende tumorceller.
Resektionsvolumenet steg signifikant, når der blev udført to rotationer af skæreåbningen, hvilket muliggjorde optimering af resektionsvolumen i henhold til tumorbyrden. Sammenligning af overlevelse hos mus med ubehandlede tumorer versus mus, der gennemgår resektion af tumorer af MIRS, viste en stigning i overlevelsen fra 16 til 22 dage i den lille tumorgruppe. Tilsvarende steg medianoverlevelsen i gruppen med en større tumorbyrde fra 12 til 19 dage.
Lysmikroskopibilleder af prøverne taget fra vævsbevaringssystemet optrådte som enkeltceller med tilstedeværelsen af et par små stykker væv på dag nul. Efter syv dage viste cellerne høstet med MIRS neurosfæredannelse i suspensionskulturer, hvilket indikerede deres tumorinitieringspotentiale. Det er vigtigt at rense og skylle slangesystemet lige efter proceduren for at undgå tilstopning af systemet.
Efter denne procedure kan effektstudier af terapi og undersøgelser af diagnostiske og prognostiske markører anvendes på overlevende dyr efter kirurgisk resektion med det minimalt invasive resektionssystem.