Alle organismer har uorden i deres proteom, estimert opptil 33%Disse regionene kan observeres ved hydrogen / deuteriumutveksling massespektrometri, men bare i millisekundets tidsintervall. Vår protokoll vil vise deg hvordan du gjør dette vellykket. Dette er en helautomatisk analytisk teknikk.
Du bare setter opp alt, programmerer de ønskede tidsmålingene, trykker på gå og gå bort. Denne teknikken åpner for den spennende muligheten til screening for forbindelser som stabiliserer spesifikke bekreftelser av intrinsically disordered proteiner som alfa-synuclein. For å begynne prøvepreparering for peptidkartlegging, ta først et hetteglass med lagret alfa-synucleinproteinlager fra fryseren på minus 80 grader Celsius.
Og når den er tint, filtrer med et 0,22 mikrometer sprøytefilter. Mål deretter absorbansen av løsningen ved 218 nanometer for å bestemme proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Beer-Lamberts lov, og fortynn proteinet med likevektsbuffer til en endelig konsentrasjon på fem mikromolar. Deretter, for å sette opp autosamplerroboten, legg til 50 mikroliter av de fem mikromolar proteinoppløsningene til et hetteglass med total utvinning, og plasser hetteglasset i prøveposisjonen i høyre kammer av hydrogen / deuteriumutvekslingen, eller HDX, robotikk i tråd med massespektrometeret.
Sett deretter ett hetteglass med likevektsbuffer og to hetteglass med pepsinvaskbuffer for å reagensere posisjonene ett, fire og fem av de venstre kamrene og ett hetteglass med slukkebuffer for å reagensposisjonere ett i HDX høyre kammer og stille temperaturen til 20 grader Celsius ved hjelp av Peltier temperaturregulator. Deretter tilsettes et likt antall hetteglass med total restitusjon og hetteglass med maksimal restitusjon i de samme reaksjonsposisjonene til henholdsvis HDX venstre kammer og HDX høyre kammer. Deretter setter du opp en eksempelliste med passende LC- og MS-metoder i planleggingsprogramvaren og starter tidsplanen.
For å få det endelige peptiddekningskartet, kurater manuelt isotopoppgavene i DynamX HDX dataanalyseprogramvare. Etter rengjøring av Fast HDX-prototypeinstrumentet, åpner du det grafiske brukergrensesnittet til den kompatible HDX-programvaren for å initialisere systemet. Skriv inn 20 grader Celsius og 0,5 grader Celsius som henholdsvis prøvekammeret og slukkekammertemperaturene, etterfulgt av å klikke på sett for å bruke de nye temperaturene.
For å rengjøre og klargjøre instrumentet, sett opp sentrifugerørene med vann av LC/MS-grad ved alle innløp, kontroller deretter både venstre og høyre sprøyte i titratorens rørleggerfunksjonsfane og fortsett å klikke prime til alle latente luftbobler i rørene er borte. For å sjekke alle boksene for sprøyter, gå først til makrofanen og klikk på kalibrer sprøyter hjemmeposisjon, klikk deretter først vaske sprøytebelastningssløyfe, etterfulgt av vask alle blandesløyfevolumer. Hvis det er en boble i en buffersprøyte, kobler du fra sprøyten og avfetter den ved å kaste ut boblen vertikalt.
Før sprøyten kalibreres på nytt til nullstilling, må du bytte ut sprøyten. For å sette opp Fast HDX-prototypeinstrumentet for HDX-eksperimenter, må du først sette inn det venstre titreringsinnløpsrøret i hetteglasset med total restitusjon. For å forhindre temperaturindusert oligomerisering og aggregering, plasser røret i et kjøleskap på bordplaten.
Deretter legger du til 50 ml likevekt, merking, slukking og pepsinvaskbuffere til de respektive bufferinntakene i instrumentets høyre og venstre kamre, etterfulgt av å legge til 50 milliliter kolonnevaskbuffer til pepsinvaskeinnløpet. For klargjøring av protein- og kolonnevaskelinjene, sjekk høyre og venstre sprøyte i titratorens rørleggerfunksjonsfane og klikk prime en gang. Etter å ha sjekket alle boksene for sprøyter som vist tidligere, gå til den manuelle slukkeflytfanen for å angi de nødvendige innstillingene.
For et tidskurseksperiment, bruk den symbolske prikkknappen for å angi tidene i millisekunder. Sett deretter felletiden til tre og vent på at HPLC skal felle tid pluss kjøretid pluss 1.5 minutter. Hvis det kjøres tomme eksperimenter mellom eksempelkjøringer, klikker du på den tomme Kjør-boksen etter at du har sikret en oppføring i anskaffelsesprogramvaren for den tomme kjøringen etter hver prøvekjøring.
Når eksempellisten er klar og de riktige oppføringene er uthevet, starter du kjøringen ved å klikke på spill og Rask HDX i programvaren. For databehandling åpner du filmenyen til filen med spektralt tildelte peptider fra peptidkartleggingseksperimentene og klikker på åpne i DynamX-programvaren, og deretter importerer du råfilene til DynamX-programvaren. Etter å ha åpnet datamenyen, klikk på MS-filer.
For å lage tilstander for hver proteintilstand som studeres, klikk på ny tilstand. For å legge til hvert HDX-tidspunkt, klikk på ny eksponering, og klikk deretter på ny rå. Hvis du vil importere RAW-filer, drar du hver fil til riktig posisjon og klikker OK når du er ferdig.
Etter automatisk tildeling av isotoper, kuraterer du isotopoppgaven manuelt for å sikre høy datakvalitet. Eksporter klyngedataene i csv-filen med kolonnerekkefølgen som beskrevet i manuskriptet. Åpne datamenyen i programvaren for massemåling og klikk på eksporter klyngedata.
For dataanalyse må du først laste inn de eksporterte klyngedataene i HDX-analyseprogramvaren HDfleX. For å passe til eksperimentelle data for alle eksperimenter og tilstander, velg passende ryggutvekslingskorreksjonsmetoder for å få de observerte hastighetskonstantene for HDX-reaksjonen. Beregn deretter en global signifikansterskel ved hjelp av en foretrukket metode i HDfleX og utfør hybrid signifikanstesting for å bestemme de signifikante forskjellene mellom statene sammenlignet.
Kartleggingseksperimentet på alfa-synuclein genererte et peptiddekningskart som dekket 100% av proteinsekvensen med en gjennomsnittlig redundans på 3,79. Videre muliggjorde denne protokollen generering av deuteriumopptakskurver for forskjellige peptider av alfa-synuclein, som deretter ble uttrykt som monterte og tilbake utvekslingskorrigerte grafer. Det var tydelig at det meste av hydrogen / deuteriumutveksling i alfa-synuclein ble gjort med ett sekund.
Konformasjonsforskjellen mellom tilstand A og B av alfa-synuclein var også tydelig fra det høyere deuteriumopptaket ved tilstand B både ved peptid- og aminosyrenivå. For en slik sensitiv teknikk er det viktig å bruke robuste statistiske signifikanstester når man sammenligner data. Her brukte vi programvaren vår HDfleX.