Name: analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

이 작업은 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01 HL144777 (MVW)의 지원을받습니다.

설치류에 대해 수행 된 연구는 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 따랐으며 미시간 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구를 위해, 근육 세포는 체중이 200g5 인 3-34 개월 된 Sprague-Dawley 및 F344BN 쥐≥ 분리되었습니다. 남성과 여성 요금이 모두 사용되었습니다.
1. 수축 기능 연구를 위한 근세포 ?...

<ol>
	<li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+of+heart+failure.">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li><li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium.">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts.">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).</li><li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging.">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li><li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+myocardial+Ca2++cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart.">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li><li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte:+A+review+of+fundamental+concepts.">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li><li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cardiac+myocytes.">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+heart+performance+by+gene+transfer.">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li><li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin.">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li><li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2++transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes.">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li><li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle.">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure.">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li><li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes.">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).</li><li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+future+of+probenecid.">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation.">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2+-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy.">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li><li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+basis+of+Starling's+law+of+the+heart:+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume.">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li><li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart.">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li><li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+and+[Ca2+]+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats.">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li></ol>

1단계에 설명된 만성 페이싱 프로토콜은 분리된 근세포를 연구하고 더 긴 치료의 영향을 평가하는 데 유용한 시간을 연장합니다. 우리 실험실에서는 만성적으로 진행되는 근육 세포에서 근절 길이를 사용하여 수축 기능을 측정 할 때 격리 후 최대 4 일까지 일관된 결과를 얻었습니다. 그러나 근세포 수축 기능은 근세포의 속도를 조절하기 위해 1주일 이상 된 배지를 사용할 때 빠르게 악화됩니다.<...

심장 펌프 기능의 분석은 특히 심부전(HF)의 동물 모델에서 적절한 통찰력을 얻기 위해 다양한 접근법을 필요로 하는 경우가 많습니다. 심 초음파 또는 혈역학 적 측정은 생체 내 심장 기능 장애1에 대한 통찰력을 제공하는 반면, 체외 접근법은 종종 기능 장애가 여기 결합 또는 활동 전위와 수축 기능 (예 : 여기 수축 [E-C] 결합)을 담당하는 근필라멘트 및 / 또는Ca 2+ 과도 현상의 변화로 인해 발생하는지 여부를 식별하는 데 사용됩니다. 시험관내 접근법은 또한 비용이 많이 들거나 힘든 생체내 치료 전략을 추구하기 전에 신경호르몬, 벡터-유도된 유전적 변형 및 잠재적인 치료제2에 대한 기능적 반응을 스크리닝할 수 있는 기회를 제공한다.
HF 5,6의 존재 및 부재 하에서 손상되지 않은 근세포에서의 무부하 단축 및Ca 2+ 과도 현상뿐만 아니라 손상되지 않은 섬유주3 또는 투과화 된 근육 세포4에서의 힘 측정을 포함하여 시험관 내 수축 기능을 조사하기 위해 여러 접근법을 사용할 수 있습니다. 이러한 각 접근법은 심장 펌프 기능 2,7을 직접 담당하는 심장 근육 세포 수축 기능에 중점을 둡니다. 그러나, 수축 및 E-C 결합 둘 다의 분석은 단리된,Ca2+ 내성 성인 근세포에서 근육 길이 및Ca2+ 과도 현상의 단축을 측정함으로써 가장 자주 수행된다. 실험실은 이8단계를 위해 쥐 심장에서 근세포를 분리하기 위해 상세한 공개된 프로토콜을 활용합니다.
Ca 2+ 일시적 및 근섬유 모두 손상되지 않은 근세포의 단축 및 재연장에 기여하며 수축성 기능 장애에 기여할 수 있습니다 2,7. 따라서, 이 접근법은 시험관내 기능 분석에 Ca2+ 사이클링 기계와 미오필라멘트를 포함하는 온전한 근세포가 필요할 때 권장된다. 예를 들어, 온전한 단리된 근세포는유전자 전달9을 통해 근필라멘트 또는Ca2+ 순환 기능을 변형시킨 후 수축 기능을 연구하는 데 바람직하다. 또한, 다운스트림 제2 메신저 신호전달 경로의 영향 및/또는 치료제2에 대한 반응을 연구할 때 신경호르몬의 기능적 영향을 분석하기 위해 온전한 근세포 접근법이 제안된다. 단일 근육 세포에서 부하 의존적 힘의 대안적인 측정은 저온 (≤15 ° C)에서 막 투과화 (또는 스키닝) 후에Ca2+ 과도 기여를 제거하고 근섬유 기능10에 초점을 맞추기 위해 가장 자주 수행됩니다. 손상되지 않은 근세포에서 부하 의존적 힘과Ca 2+ 과도 현상의 측정은 특히 신경 호르몬 신호 전달에 대한 반응을 측정하거나 치료제에 대한 스크린과 같이 더 높은 처리량이 필요한 경우 접근법11의 복잡하고 기술적 인 도전으로 인해 드뭅니다. 심장 섬유주의 분석은 이러한 기술적 문제를 극복하지만 비근세포, 섬유증 및/또는 세포외기질 리모델링의 영향을 받을 수도 있습니다2. 신생아 근세포 및 유도성 만능줄기세포(iPSC)로부터 유래된 근세포는 아직 성체 근필라멘트 단백질의 완전한 보체를 발현하지 못하고 일반적으로 성체 막대형 근세포에 존재하는 근필라멘트 조직의 수준이 부족하기 때문에 상술한 각각의 접근법은 성체 근세포를 함유하는 제제를 필요로한다2. 현재까지 iPSC의 증거는 성체 이소 형으로의 완전한 전환이 배양12에서 134 일 이상을 초과한다는 것을 나타냅니다.
HF에 대한 이 수집의 초점을 감안할 때, 프로토콜에는 실패한 것과 실패하지 않는 손상되지 않은 온전한 근세포에서 수축 기능을 구별하기 위한 접근 방식과 분석이 포함됩니다. 대표적인 예는 앞서 설명한 신장 상부 축착 후 18-20주 후에 연구된 쥐 근세포로부터 제공된다(5,13). 그런 다음 가짜 처리 된 쥐의 근육 세포와 비교합니다.
여기에 설명된 프로토콜 및 이미징 플랫폼은 HF 발달 동안 막대 모양의 심장 근세포에서 단축 및Ca 2+ 과도 현상의 변화를 분석하고 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 분석을 위해, 2 x 104 Ca2+-내성, 막대-형상의 근세포를 22mm2 라미닌-코팅된 유리 커버슬립(CSs) 상에 플레이팅하고, 앞서8에 기술된 바와 같이 밤새 배양하였다. 이 이미징 플랫폼을 위해 조립된 구성 요소는 최적의 이미징에 사용되는 미디어 및 버퍼와 함께 재료 표에 제공됩니다. 소프트웨어를 사용한 데이터 분석 가이드와 대표 결과도 여기에 제공됩니다. 전체 프로토콜은 별도의 하위 섹션으로 나뉘며, 처음 세 섹션은 분리된 쥐 근세포 및 데이터 분석에 초점을 맞추고 세포 Ca2+ 과도 실험 및 근세포에서의 데이터 분석이 이어집니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEDIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Final concentration = 0.2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-6529</td>
			<td>Final concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td>Final concentration = 15 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2520</td>
			<td>1 bottle makes 1 L; pH 7.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8875</td>
			<td>Final concentration = 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>F1221</td>
			<td>50 &#956;g/vial;&#160; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;&#160; Final Fura2-AM concentration in media is&#160; 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenicid</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>P36400</td>
			<td>Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22&#160; mm2 glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2845-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 36 inch cables with banana jacks</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>B-36-2</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator&#160; with 95% O2:5% CO2&#160;</td>
			<td>Forma</td>
			<td>3110</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel E.&#160; Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp</td>
			<td>Forma</td>
			<td>1286</td>
			<td>Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 5/45</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1800-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low magnification inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM-IL&#160;</td>
			<td>Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; &#160;4X and 10X objectives recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ID in Supplemental Figure 2 &#38; Alternatives/Recommended Options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional components for Ca2+ imaging analysis</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Essential system components: -- Photon counting system&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Xenon power supply with dual excitation light source&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Fluorescence interface</td>
			<td>&#160;- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera&#160; (panel A #4).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm&#160; excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The fluorescence interface between the computer and&#160; light source is shown in panel B, #12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera with image acquisition&#160; hardware and software (240 frames/s)</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myocam with CCD controller&#160;</td>
			<td>Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4&#160; and&#160; panel A #5 &#38; panel C #5 (right), respectively.&#160; The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Chamber stimulator</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Panel B, #13; Alternative:&#160; Grass model S48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip mounted perfusion chamber</td>
			<td>Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws&#160; (arrow, panel F)</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #10 &#38; panel F;&#160;&#160; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).&#160; Commercial alternatives:&#160; Ionoptix FHD or C-stim cell&#160; chambers; Cell MicroControls culture stimulation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dedicated computer &#38; software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>PC with Ionwizard PC board and software</td>
			<td>Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric&#160; Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. 
			- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.&#160; The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 TI</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Panel F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated tube holder for media</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam &#38; a pre-heated gel pack to keep media warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted brightfield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000S</td>
			<td>Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.&#160; &#160;A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator Table</td>
			<td>TMC Vibration Control</td>
			<td>30 x 36 inches</td>
			<td>Panel A, #1; Desirable:&#160; elevated shelving, Faraday shielding&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope eyepieces &#38; objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective</td>
			<td>Panel A #3; 40X objective:&#160; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&#160; A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;NOTE:&#160; water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>Panel A #8 and panel E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small weigh boat</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Cell MicroControls</td>
			<td>TC2BIP</td>
			<td>Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.&#160;&#160;&#160; A preheater and objective heater are recommended for this platform.&#160; A Cell MicroControls HPRE2 preheater and&#160; HLS-1 objective heater are controlled&#160; by the TC2BIP temperature controller for our studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under cabinet LED light with motion sensor&#160;</td>
			<td>Sylvania</td>
			<td>#72423 LED light</td>
			<td>Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..&#160; Alternative:&#160; A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask &#38; protective filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Tygon tubing - E363;&#160; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90</td>
			<td>Panel A #11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes

수축성 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상은 종종 심장 유발 손상 및/또는 리모델링에 대한 포괄적인 평가의 일부로 세포 수준에서 분석됩니다. 이러한 기능적 변화를 평가하기 위한 한 가지 접근법은 원발성 성인 심장 근세포에서 무부하 단축 및Ca 2+ 과도 분석을 활용합니다. 이 접근법을 위해, 성체 근세포는 콜라게나제 소화에 의해 분리되고,Ca 2+ 에 내성이 있게 된 다음, 라미닌 코팅 커버슬립에 부착된 다음, 무혈청 배지에서 전기 페이싱을 한다. 일반적인 프로토콜은 성인 쥐 심장 근육 세포를 사용하지만 다른 종의 원발성 근육 세포에 대해 쉽게 조정할 수 있습니다. 손상된 심장에서 근육 세포의 기능적 변화는 가짜 근육 세포 및 / 또는 시험관 내 치료 치료와 비교 될 수 있습니다. 이 방법론에는 세포실 및 플랫폼 구성 요소와 함께 근세포 페이싱에 필요한 필수 요소가 포함됩니다. 이 접근법에 대한 자세한 프로토콜은 원시 데이터 분석뿐만 아니라 비율 측정 지표 Fura-2 AM으로 측정 된 근절 길이 감지 및 셀룰러Ca 2+ 과도 현상에 의한 무부하 단축을 측정하는 단계를 통합합니다.

수축 기능 연구는 격리 다음날(2일차)부터 격리 후 최대 4일까지 쥐 근세포에 대해 수행됩니다. 근육 세포는 분리 다음 날 (즉, 2 일째)에 기록 될 수 있지만, 수축 기능을 수정하기 위해 유전자 전달 또는 치료 후 더 긴 배양 시간이 종종 필요합니다8. 분리 후 18시간 이상 배양된 근세포의 경우, 섹션 1에 설명된 페이싱 프로토콜은 t-세뇨관과 일관된 단축 및 재연장 결과를 유지하는...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

분리된 쥐 근세포에서 칼슘(Ca 2+) 과도 측정과 함께 근절 길이 검출을 통한 수축 기능의 측정을 설명하는 일련의 프로토콜이 제시됩니다. 심부전 동물 모델에서의 연구에 대한이 접근법의 적용도 포함됩니다.

설치류 근육 세포에서 심장 수축 기능 장애 및Ca 2+ 과도 현상 분석

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

이 접근법은 심부전 발병 중 수축 기능의 변화를 감지합니다. 신경 호르몬 및 잠재적 치료제에 대한 근육 세포의 기능적 반응도 스크리닝 할 수 있습니다. 근세포를 배치하는 것은 연습이 필요할 수 있지만 일관된 근절 길이 영상을 얻는 데 필수적입니다.이 절차를 시연하는 것은 실험실의 부교수이자 수석 연구원 인 Margaret Westfall입니다. 실험을 시작하기 전에 섭씨 37 도의 인큐베이터에서 젤 팩과 배지를 30 분 동안 예열하십시오. 원고에 언급된 수축 기능 플랫폼 구성 요소를 켜고 튜브를 연동 펌프에 조립합니다.그런 다음 예열 된 젤 팩을 튜브 홀더로 옮기고 세포 자극기의 진공을 켭니다. 절연 튜브 홀더에 매체가 있는 50밀리리터 튜브를 놓아 연동 펌프 튜브를 통해 분당 0.5밀리리터의 관류를 시작합니다. 다음으로, 예열된 배지 2ml를 소형 계량 보트에 추가하고 근세포가 포함된 커버 슬립 1개를 자극 챔버에서 계량 보트로 옮깁니다.자극 챔버를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터로 되돌립니다. 계량 보트에서 커버 슬립을 제거하고 밑면을 부드럽게 닦은 후 새로 그리스를 칠한 커버 슬립 챔버로 옮기고 커버 슬립에 미디어 한 방울을 추가합니다. 커버 슬립 위에 백금 전극 마운트를 놓은 다음 집게로 상단 위에 새 커버 슬립을 놓고 커버 슬립 샌드위치 위에 상단 마운트를 놓습니다.2개 또는 4개의 제로 팬헤드 나사를 설치하여 챔버 조립을 완료합니다. 연동 펌프에서 매체가 튜브 전체에 존재할 때 튜브를 예열기에 부착하고 예열기를 커버 슬립 챔버에 부착합니다. 그런 다음 분당 0.5ml로 관류를 시작하고 누출이 없는지 확인하기 위해 챔버 아래에 티슈 닦음을 놓습니다.커버 슬립 챔버를 현미경의 스테이지 어댑터에 놓은 후 가열 시스템을 켜고 5-10분 동안 어셈블리를 평형화하여 챔버 중앙에서 섭씨 37도의 일정한 매체 온도를 달성합니다. 진공 시스템에 연결된 튜브로 챔버의 반대쪽 끝에서 수집되는 관류 매체를 관찰하십시오. 평형 시간 동안 현미경에서 40x 물 침지 대물렌즈로 근세포를 시각화합니다.페이싱 자극기를 활성화하려면 전압을 35-40V로 설정하고 자극 주파수를 0.2Hz로 조정하여 수축 기능과 근세포 생존을 최적화하십시오. 근절 단축 추적을 수집하려면 컴퓨터에서 소프트웨어를 열고 확인, 파일 및 새 탭을 선택하십시오. 추적을 선택하고 사용자 제한 및 근본 길이를 편집하여 화면 템플릿을 준비합니다.파일 및 새 탭으로 근절 길이 추적을 기록하고, 수축하는 근세포를 식별하고, 줄무늬 패턴이 수직이 되도록 카메라의 세로축을 따라 근세포를 배치합니다. 컴퓨터 마우스를 사용하여 관심 영역 또는 ROI 상자를 근세포 위에 놓습니다. 수집 및 시작을 선택하여 수축 기능을 기록합니다.0.5 헤르츠의 낮은 자극 주파수에서 각 근육 세포에서 60 초 동안 단축을 기록합니다. 표지 전표 당 5 개에서 10 개의 세포로 근절 단축을 기록하십시오. 주파수 범위에서 단축을 측정하려면 각 주파수에 근세포를 배치하여 기록 전에 정상 상태 단축을 얻습니다.관류 속도를 두 배로 늘리고 자극 후 0.2-2 헤르츠 범위의 새로운 주파수에서 15-20 초 동안 기록을 시작하고 주어진 자극 주파수 범위에서 단축하기 위해 커버 슬립 당 2 개 이하의 근육 세포를 기록합니다. 신뢰할 수 있는 신호 평균 데이터를 얻기 위해 셀당 최소 7개의 수축을 기록합니다. 파일을 선택하고 기록된 추적을 선택한 다음 열기를 선택합니다.기본 추적 중 하나를 탭으로 선택한 다음 추적 맨 위에 노란색 패널을 설정하여 sarc 길이를 가져옵니다. 메뉴에서 필요한 옵션의 T Zero 상자 정의에 작업 단조 과도 분석 옵션 및 TTL 이벤트 표시가있는 분석 템플릿을 준비합니다. 템플릿을 선택하여 이러한 분석 옵션을 저장하고 분석 템플릿을 식별자와 함께 저장합니다.각 추적을 분석하기 전에 분석 템플릿을 로드합니다. 데이터를 분석하려면 마크, 게이트를 선택하고 과도 상태를 추가한 다음 이벤트 마크 및 분석 범위에서 변환합니다. 0.2Hz에서 진행되는 근세포의 시간 범위를 마이너스 0.01초에서 1.20초 사이로 설정합니다.더 높은 주파수에서 자극되는 근육 세포에 대해 더 짧은 시간 범위를 선택하십시오. 작업 및 평균 이벤트를 선택하여 원래 기본 트레이스 아래의 신호 평균 기록을 생성합니다. 그런 다음 신호 평균 트레이스 중 하나를 탭한 다음 상단 메뉴의 표시로 이동한 다음 과도 상태 추가, 작업 및 단조 과도 분석을 선택하여 신호 평균 디스플레이 패널에 기준선 육종 파라미터에 대한 신호 평균 값을 표시합니다.단조 과도 분석 및 클립보드 전류 내보내기를 선택하고 과도 근절 분석을 스프레드시트로 전송하여 여러 근세포의 복합 분석을 수행합니다. 신호 평균 트레이스를 복사하려면 내보내기, 현재 트레이스, 클립보드 및 옵션 탭을 순서대로 선택하고 소수 자릿수를 5로 설정합니다. 탭 구분 기호를 선택하고 확인을 클릭합니다.각 근세포 기록에 대한 신호 평균 트레이스의 속도를 두 번째 스프레드시트로 조정합니다. 이 연구는 압력 과부하 또는 PO가 가짜 그룹과 비교할 때 근육 세포의 수축 기능을 감소 시킨다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 심장 트로포 닌 IT 144D 또는 cTnIT144D의 유전자 전달 4 일 후, PO 근육 세포의 수축 능력은 가짜 수준으로 돌아 왔으며, 이는 근육 세포 기능이 회복 될 수 있음을 나타낸다.초기 연구에서 cTnIT144D의 유전자 전달은 CTnI에 비해 피크 단축 및 이완기 칼슘 수치 상승을 향상시켰습니다. 명확한 단축 흔적을 얻기 위해 심장 근육 세포의 위치를 미세 조정해야합니다. 이 프로토콜은 Fura-2 AM과 같은 칼슘에 민감한 형광 염료가 로딩 된 심장 근육 세포에서도 수행하여 단축 외에도 칼슘 과도 현상을 감지 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

쥐에서 초음파 기술을 사용하여 약물 유발 신장 혈역학 적 부전의 조기 발견

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

연구

의학

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

자궁 원격 측정은 마우스 수축 압력을 측정하는<em&gt; 생체</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

메타볼로믹스 및 리피도믹스 분석을 위한 뇌종양의 현장 샘플링 및 추출

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

심한 난소 기능 장애 환자에서 불 임 보존

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

온전한 심낭 허혈성 설치류 모델

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

로스 수술의 설치류 모델: 전신 위치에 있는 합성 폐 동맥 이식 이식

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...