Name: analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01 HL144777 (MVW).

Studier utförda på gnagare följde folkhälsopolitiken för human vård och användning av laboratoriedjur och godkändes av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. För denna studie isolerades myocyter från 3-34 månader gamla Sprague-Dawley och F344BN råttor som väger ≥ 200 g5. Både manliga och kvinnliga priser användes.
1. Myocytpacing för kontraktila funktionsstudier
<ol><li>Gör färska M199-baserade medier f...

<ol>
	<li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+of+heart+failure.">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li><li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium.">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts.">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).</li><li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging.">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li><li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+myocardial+Ca2++cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart.">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li><li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte:+A+review+of+fundamental+concepts.">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li><li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cardiac+myocytes.">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+heart+performance+by+gene+transfer.">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li><li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin.">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li><li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2++transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes.">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li><li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle.">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure.">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li><li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes.">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).</li><li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+future+of+probenecid.">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation.">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2+-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy.">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li><li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+basis+of+Starling's+law+of+the+heart:+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume.">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li><li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart.">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li><li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+and+[Ca2+]+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats.">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li></ol>

Det kroniska pacingprotokollet som beskrivs i steg 1 förlänger den användbara tiden för att studera isolerade myocyter och bedöma effekterna av längre behandlingar. I vårt laboratorium erhölls konsekventa resultat upp till 4 dagar efter isolering vid mätning av kontraktil funktion med sarkomerlängd på kroniskt tempo myocyter. Myocytkontraktilfunktionen försämras emellertid snabbt när man använder media som är äldre än 1 vecka för att takta myocyter.
För kontraktila funktion...

Analysen av hjärtpumpens funktion kräver ofta en rad metoder för att få tillräcklig insikt, särskilt för djurmodeller av hjärtsvikt (HF). Ekokardiografi eller hemodynamiska mätningar ger insikt i in vivo hjärtdysfunktion1, medan in vitro-metoder ofta används för att identifiera om dysfunktion uppstår från förändringar i myofilamentet och / eller Ca2+ övergående som är ansvarig för att koppla excitation, eller åtgärdspotentialen, med kontraktil funktion (t.ex. excitation-sammandragning [E-C] koppling). In vitro-metoder ger också en möjlighet att screena det funktionella svaret på neurohormoner, vektorinducerade genetiska förändringar samt potentiella terapeutiska medel2 innan man fortsätter med kostsamma och / eller mödosamma in vivo-behandlingsstrategier .
Flera metoder finns tillgängliga för att undersöka in vitro-kontraktil funktion, inklusive kraftmätningar i intakta trabeculae3 eller permeabiliserade myocyter4, samt lossat förkortning och Ca2+ transienter i intakta myocyter i närvaro och frånvaro av HF 5,6. Var och en av dessa metoder fokuserar på hjärtmyocytkontraktil funktion, som är direkt ansvarig för hjärtpumpfunktionen 2,7. Analysen av både sammandragning och E-C-koppling tillsammans utförs emellertid oftast genom att mäta förkortning av muskellängden och Ca 2+ transienter i isolerade, Ca2+ toleranta vuxna myocyter. Laboratoriet använder ett detaljerat publicerat protokoll för att isolera myocyter från råtthjärtan för detta steg8.
Både Ca2+ övergående och myofilament bidrar till förkortning och förlängning i intakta myocyter och kan bidra till kontraktil dysfunktion 2,7. Således rekommenderas detta tillvägagångssätt när in vitro-funktionell analys kräver en intakt myocyt som innehåller Ca2+ cykelmaskiner plus myofilamenten. Till exempel är intakta isolerade myocyter önskvärda för att studera kontraktil funktion efter modifiering av myofilamentet eller Ca2+ cykelfunktionen via genöverföring9. Dessutom föreslås en intakt myocytmetod för att analysera den funktionella effekten av neurohormoner när man studerar effekten av nedströms andra budbärarsignalvägar och / eller svar på terapeutiska medel2. En alternativ mätning av belastningsberoende kraft i enstaka myocyter utförs oftast efter membranpermeabilisering (eller flåsning) vid låga temperaturer (≤15 °C) för att avlägsna Ca2+ övergående bidrag och fokusera på myofilamentfunktion10. Mätningen av belastningsberoende kraft plus Ca2+ transienter i intakta myocyter är sällsynt på grund av den komplexa och tekniska utmaningen med tillvägagångssättet11, särskilt när högre genomströmning behövs, såsom för att mäta svar på neurohormonsignalering eller som en skärm för terapeutiska medel. Analysen av hjärttrabeculae övervinner dessa tekniska utmaningar men kan också påverkas av icke-myocyter, fibros och / eller extracellulär matrisombyggnad2. Var och en av de metoder som beskrivs ovan kräver ett preparat som innehåller vuxna myocyter eftersom neonatala myocyter och myocyter härledda från inducerbara pluripotenta stamceller (iPSC) ännu inte uttrycker det fullständiga komplementet av vuxna myofilamentproteiner och vanligtvis saknar nivån av myofilamentorganisation som finns i den vuxna stavformade myocyten2. Hittills indikerar bevis i iPSC att den fullständiga övergången till vuxna isoformer överstiger mer än 134 dagar i kultur12.
Med tanke på fokus för denna samling på HF inkluderar protokollen tillvägagångssätt och analys för att skilja kontraktil funktion vid misslyckande kontra icke-sviktande intakta myocyter. Representativa exempel ges från råttmyocyter som studerats 18-20 veckor efter en supra-renal koarctation, beskriven tidigare 5,13. Jämförelser görs sedan med myocyter från bluffbehandlade råttor.
Protokollet och bildplattformen som beskrivs här används för att analysera och övervaka förändringar i förkortning och Ca2+ transienter i stavformade hjärtmyocyter under utvecklingen av HF. För denna analys pläteras 2 x 104 Ca 2+-toleranta, stavformade myocyter på22 mm2 lamininbelagda glasöverdrag (CS) och odlas över natten, som beskrivits tidigare8. Komponenterna monterade för denna bildplattform, tillsammans med media och buffertar som används för optimal avbildning, finns i materialförteckningen. En guide för dataanalys med hjälp av en programvara och de representativa resultaten finns också här. Det övergripande protokollet är uppdelat i separata underavsnitt, med de tre första avsnitten som fokuserar på isolerade råttmyocyter och dataanalys, följt av cellulära Ca2+ övergående experiment och dataanalys i myocyter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEDIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Final concentration = 0.2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-6529</td>
			<td>Final concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td>Final concentration = 15 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2520</td>
			<td>1 bottle makes 1 L; pH 7.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8875</td>
			<td>Final concentration = 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>F1221</td>
			<td>50 &#956;g/vial;&#160; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;&#160; Final Fura2-AM concentration in media is&#160; 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenicid</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>P36400</td>
			<td>Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22&#160; mm2 glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2845-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 36 inch cables with banana jacks</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>B-36-2</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator&#160; with 95% O2:5% CO2&#160;</td>
			<td>Forma</td>
			<td>3110</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel E.&#160; Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp</td>
			<td>Forma</td>
			<td>1286</td>
			<td>Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 5/45</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1800-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low magnification inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM-IL&#160;</td>
			<td>Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; &#160;4X and 10X objectives recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ID in Supplemental Figure 2 &#38; Alternatives/Recommended Options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional components for Ca2+ imaging analysis</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Essential system components: -- Photon counting system&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Xenon power supply with dual excitation light source&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Fluorescence interface</td>
			<td>&#160;- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera&#160; (panel A #4).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm&#160; excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The fluorescence interface between the computer and&#160; light source is shown in panel B, #12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera with image acquisition&#160; hardware and software (240 frames/s)</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myocam with CCD controller&#160;</td>
			<td>Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4&#160; and&#160; panel A #5 &#38; panel C #5 (right), respectively.&#160; The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Chamber stimulator</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Panel B, #13; Alternative:&#160; Grass model S48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip mounted perfusion chamber</td>
			<td>Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws&#160; (arrow, panel F)</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #10 &#38; panel F;&#160;&#160; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).&#160; Commercial alternatives:&#160; Ionoptix FHD or C-stim cell&#160; chambers; Cell MicroControls culture stimulation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dedicated computer &#38; software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>PC with Ionwizard PC board and software</td>
			<td>Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric&#160; Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. 
			- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.&#160; The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 TI</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Panel F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated tube holder for media</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam &#38; a pre-heated gel pack to keep media warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted brightfield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000S</td>
			<td>Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.&#160; &#160;A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator Table</td>
			<td>TMC Vibration Control</td>
			<td>30 x 36 inches</td>
			<td>Panel A, #1; Desirable:&#160; elevated shelving, Faraday shielding&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope eyepieces &#38; objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective</td>
			<td>Panel A #3; 40X objective:&#160; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&#160; A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;NOTE:&#160; water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>Panel A #8 and panel E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small weigh boat</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Cell MicroControls</td>
			<td>TC2BIP</td>
			<td>Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.&#160;&#160;&#160; A preheater and objective heater are recommended for this platform.&#160; A Cell MicroControls HPRE2 preheater and&#160; HLS-1 objective heater are controlled&#160; by the TC2BIP temperature controller for our studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under cabinet LED light with motion sensor&#160;</td>
			<td>Sylvania</td>
			<td>#72423 LED light</td>
			<td>Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..&#160; Alternative:&#160; A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask &#38; protective filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Tygon tubing - E363;&#160; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90</td>
			<td>Panel A #11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes

Kontraktil dysfunktion och Ca2+ transienter analyseras ofta på cellnivå som en del av en omfattande bedömning av hjärtinducerad skada och / eller ombyggnad. Ett tillvägagångssätt för att bedöma dessa funktionella förändringar använder lossad förkortning och Ca2+ övergående analyser i primära vuxna hjärtmyocyter. För detta tillvägagångssätt isoleras vuxna myocyter genom kollagenasförtunning, görs Ca2+ toleranta och fästs sedan vid lamininbelagda täckglas, följt av elektrisk pacing i serumfria medier. Det allmänna protokollet använder vuxna råtta hjärtmyocyter men kan lätt justeras för primära myocyter från andra arter. Funktionella förändringar i myocyter från skadade hjärtan kan jämföras med skenmyocyter och/eller med in vitro-terapeutiska behandlingar. Metoden inkluderar de väsentliga elementen som behövs för myocytpacing, tillsammans med cellkammaren och plattformskomponenterna. Det detaljerade protokollet för detta tillvägagångssätt innehåller stegen för att mäta lossad förkortning genom sarkomerlängdsdetektering och cellulära Ca2+ transienter uppmätta med den ratiometriska indikatorn Fura-2 AM, samt för rådataanalys.

Kontraktila funktionsstudier utförs på råttmyocyter som börjar dagen efter isolering (dag 2) upp till 4 dagar efter isolering. Även om myocyter kan registreras dagen efter isolering (dvs. dag 2), krävs ofta längre odlingstider efter genöverföring eller behandlingar för att modifiera kontraktil funktion8. För myocyter odlade i mer än 18 timmar efter isolering hjälper pacingprotokollet som beskrivs i avsnitt 1 till att upprätthålla t-tubuli och konsekventa förkortnings- och förläng...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

En uppsättning protokoll presenteras som beskriver mätningen av kontraktil funktion via sarkomerlängdsdetektering tillsammans med kalcium (Ca2+) övergående mätning i isolerade råttmyocyter. Tillämpningen av detta tillvägagångssätt för studier i djurmodeller av hjärtsvikt ingår också.

Analys av hjärtkontraktil dysfunktion och Ca2+ transienter i gnagarmyocyter

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Detta tillvägagångssätt upptäcker förändringar i kontraktil funktion under utvecklingen av hjärtsvikt. Det funktionella svaret i myocyter på neurohormoner och potentiella terapeutiska medel kan också screenas. Positionering av myocyten kan ta övning men är viktigt för att få konsekvent sarkomerlängdsavbildning.Demonstrerar proceduren är Margaret Westfall, docent och huvudprövare för laboratoriet. Innan du börjar experimentet, förvärm ett gelpaket och media i en inkubator vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Slå på kontraktila funktionsplattformskomponenterna som nämns i manuskriptet och montera slangen i den peristaltiska pumpen.Överför sedan det förvärmda gelpaketet till rörhållaren och sätt på vakuumet i strömmen till cellstimulatorn. Placera ett 50 ml rör med media i den isolerade rörhållaren för att börja perfusion vid 0,5 ml per minut genom den peristaltiska pumpslangen. Tillsätt sedan två milliliter förvärmda medier till en liten vägbåt och överför en täckglidning som innehåller myocyter från stimuleringskammaren till vägbåten.Återför stimuleringskammaren till inkubatorn vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Ta bort täckbladet från vägningsbåten och torka försiktigt av undersidan innan du överför den till en nysmord täckkammare och lägger en droppe media på lockglidningen. Placera ett platinaelektrodfäste över täckslipen, lägg sedan en ny täckglidning över toppen med pincett och placera ett toppfäste över täckslipsmörgåsen.Installera två eller fyra nummer noll panheadskruvar för att slutföra monteringen av kammaren. I den peristaltiska pumpen när mediet är närvarande i hela slangen, fäst slangen på förvärmaren och förvärmaren på lockets glidkammare. Börja sedan perfusion med 0,5 ml per minut och placera en vävnadstork under kammaren för att säkerställa inga läckor.Efter att ha placerat lockets glidkammare i mikroskopets stegadapter, slå på värmesystemet och balansera enheten i fem till 10 minuter för att uppnå en konstant medietemperatur på 37 grader Celsius i mitten av kammaren. Observera det perfuserade mediet som samlas upp i motsatt ände av kammaren med slangar anslutna till ett vakuumsystem. Under jämviktstiden visualiserar du myocyter med 40x vattensänkningsmålet på mikroskopet.För att aktivera pacingstimulatorn, ställ in spänningen på 35 till 40 volt och justera stimuleringsfrekvensen till 0,2 hertz för att optimera kontraktil funktion och myocytöverlevnad. För att samla sarcomere förkortning spår, öppna programvaran på datorn och välj okej, fil och nya flikar. Förbered en skärmmall genom att välja spårningar, redigera användargränser och sarcomerelängd.Spela in sarkomerlängdsspår med filen och nya flikar, identifiera en sammandragande myocyt och placera myocyten längs kamerans längsgående axel så att strimlingsmönstret är vertikalt. Använd datormusen för att placera intresseområdet eller ROI-rutan över myocyten. Välj samla in och börja spela in kontraktilfunktionen.Spela in förkortning i 60 sekunder från varje myocyt vid låga stimuleringsfrekvenser på 0,5 hertz. Spela in sarkomerförkortning från fem till 10 celler per täckglidning. För att mäta förkortning över ett frekvensområde, placera myocyterna vid varje frekvens för att få steady state-förkortning före inspelning.Fördubbla perfusionshastigheten och börja spela in 15 till 20 sekunder efter stimulering vid en ny frekvens i intervallet 0,2 till två hertz och registrera inte mer än två myocyter per täckglidning för förkortning över det givna intervallet av stimuleringsfrekvenser. Registrera minst sju sammandragningar per cell för att få tillförlitliga signalmedelvärdesdata. Välj filen, välj en inspelad spårning och välj sedan öppen.Välj flik ett av basspårningen och ställ sedan in den gula panelen högst upp i spårningen för att få sarclängd. Förbered en analysmall med monotona alternativ för monoton tillfällig analys och TTL-händelsemarkering i rutan Definition av T Zero i de nödvändiga alternativen på menyn. Spara dessa analysalternativ genom att välja mallar och spara analysmall med en identifierare.Läs in analysmallen innan du analyserar varje spårning. Om du vill analysera data markerar du markeringar, grindar, lägger till tillfälliga och konverterar sedan från händelsemarkering och analysintervall. Ställ in tidsintervallet från minus 0,01 till 1,20 sekunder för myocyter tempo vid 0,2 hertz.Välj ett kortare tidsintervall för myocyter som stimuleras vid högre frekvenser. Välj åtgärder och genomsnittliga händelser för att skapa en signalgenomsnittsinspelning under den ursprungliga basspårningen. Välj sedan flik ett av signalmedelvärdesspårningen och gå sedan till märken på den övre menyn följt av lägg till övergående, välj operationer och monoton transient analys för att visa signalmedelvärdena för baslinje sarkomerparametrar i signalgenomsnittsdisplaypanelen.Välj exportera monoton transient analys och urklippsström och överför övergående sarkomeranalys till ett kalkylblad för sammansatt analys av flera myocyter. Om du vill kopiera signalgenomsnittsspårningen väljer du export, aktuell spårning och sedan flikarna Urklipp och alternativ i ordning och anger decimalerna till fem. Välj flikavgränsare och klicka på okej.Tempo signalen genomsnittliga spår för varje myocytinspelning i ett andra kalkylblad. Studien visade att trycköverbelastningen eller PO, minskade myocyternas kontraktila funktion jämfört med skengruppen. Men fyra dagar efter genöverföringen av hjärttroponin IT 144D eller cTnIT144D återvände kontraktilförmågan i PO-myocyterna mot skennivåer, vilket indikerar att myocytfunktionen kunde återställas.I de inledande studierna förbättrade genöverföringen av cTnIT144D toppförkortning och förhöjda diastoliska kalciumnivåer jämfört med CTnI. Finjusteringar i positionering av hjärtmyocyten behövs ofta för att få tydliga förkortningsspår. Detta protokoll kan också utföras på hjärtmyocyter laddade med kalciumkänsliga fluorescerande färgämnen såsom Fura-2 AM för att detektera kalciumtransienter förutom förkortning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Tidig upptäckt av läkemedelsinducerad njur hemodynamisk dysfunktion Använda sonografisk teknik i råttor

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetry att mäta Mouse kontraktila Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

framställning och<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering av Magnetized miR-modifierade endotelceller

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Ett flöde flödescytometri-baserad analys för att mäta mitokondriella membranet Potential i hjärt myocyter efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Isolering av Förmaksmyocyter från vuxna möss

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Provtagning på plats och utvinning av hjärntumörer för metabolomik och Lipidomics-analys

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

In vitro-bedömning av myokardskydd efter hypotermiförkonditionering i en human hjärt myocytmodell

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

Fertilitetsbevarande hos patienter med svår äggstocksdysfunktion

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

En intakt perikardium ischemisk gnagare modell

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

En gnagare modell av Ross operation: Syngeneic lungartär graft implantation i en systemisk position

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...