Name: analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe R01 HL144777 (MVW) tarafından desteklenmektedir.

Kemirgenler üzerinde yapılan çalışmalar, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası'nı izlemiş ve Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için, miyositler 3-34 aylık Sprague-Dawley ve ≥ 200 g5 ağırlığındaki F344BN sıçanlarından izole edildi. Hem erkek hem de kadın oranları kullanıldı.
1. Kasılma fonks...

<ol>
	<li>Reihle, C., Bauersachs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+models+of+heart+failure.">Small animal models of heart failure.</a> Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).</li><li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Rossman, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependent+responses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+in+human+myocardium.">Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myofilament+contractile+function+in+human+donor+and+failing+hearts.">Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).</li><li>Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+contractile+dysfunction+and+protein+kinase+C-mediated+myofilament+phosphorylation+in+disease+and+aging.">Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging.</a> The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).</li><li>Chaudhary, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+myocardial+Ca2++cycling+after+left+ventricular+assist+device+support+in+failing+human+heart.">Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).</li><li>Walker, C. A., Spinale, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+function+of+the+cardiac+myocyte:+A+review+of+fundamental+concepts.">The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).</li><li>Lang, S. E., Westfall, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cardiac+myocytes.">Gene transfer into cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).</li><li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+heart+performance+by+gene+transfer.">Designing heart performance by gene transfer.</a> Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).</li><li>Sweitzer, N. K., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+loaded+shortening+velocity+in+single+cardiac+myocytes+permeabilized+with+a-hemolysin.">Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin.</a> Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).</li><li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloaded+shortening+increases+peak+of+Ca2++transients+but+accelerates+their+decay+in+rat+single+cardiac+myocytes.">Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).</li><li>Racca, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+developing+human+fetal+cardiac+muscle.">Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle.</a> The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+protein+expression+and+basal+lamina+remodeling+in+human+heart+failure.">Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure.</a> Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).</li><li>Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody+effects+on+cellular+function+of+isolated+cardiomyocytes.">Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).</li><li>Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+future+of+probenecid.">The history and future of probenecid.</a> Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).</li><li>Sakthivel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+analysis+of+cardiac+troponin+I+phosphorylation.">In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2+-ATPase+during+progression+of+left+ventricular+hypertrophy.">Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy.</a> The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).</li><li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+basis+of+Starling's+law+of+the+heart:+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume.">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li><li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart.">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li><li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shortening+and+[Ca2+]+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats.">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li></ol>

Adım 1'de özetlenen kronik pacing protokolü, izole miyositleri incelemek ve daha uzun tedavilerin etkisini değerlendirmek için yararlı süreyi uzatır. Laboratuvarımızda kronik tempolu miyositlerde sarkomer uzunluğu kullanılarak kontraktil fonksiyon ölçülürken izolasyondan 4 gün sonrasına kadar tutarlı sonuçlar elde edilmiştir. Bununla birlikte, miyositleri hızlandırmak için 1 haftadan daha eski medya kullanıldığında miyosit kontraktil fonksiyonu hızla bozulur.
Kası...

Kardiyak pompa fonksiyonunun analizi, özellikle kalp yetmezliğinin (HF) hayvan modelleri için yeterli içgörü elde etmek için genellikle bir dizi yaklaşım gerektirir. Ekokardiyografi veya hemodinamik ölçümler in vivo kardiyak disfonksiyon1 hakkında fikir verirken, in vitro yaklaşımlar genellikle disfonksiyonun miyofilament ve / veya uyarma eşleşmesinden sorumlu Ca2 + geçici veya kontraktil fonksiyonlu aksiyon potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için kullanılır (örneğin, uyarma-kasılma [E-C] bağlantısı). İn vitro yaklaşımlar ayrıca, pahalı ve / veya zahmetli in vivo tedavi stratejilerini takip etmeden önce nörohormonlara, vektör kaynaklı genetik değişikliklere ve potansiyel terapötik ajanlara2 fonksiyonel yanıtı tarama fırsatı sunar.
İn vitro kontraktil fonksiyonu araştırmak için, sağlam trabekül3 veya geçirgenleştirilmiş miyositler4'te kuvvet ölçümlerinin yanı sıra, HF 5,6'nın varlığında ve yokluğunda sağlam miyositlerde yüksüz kısalma ve Ca2 + geçicileri de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Bu yaklaşımların her biri, kardiyak pompa fonksiyonu 2,7'den doğrudan sorumlu olan kardiyak miyosit kontraktil fonksiyonuna odaklanmaktadır. Bununla birlikte, hem kasılma hem de E-C eşleşmesinin birlikte analizi, çoğunlukla izole edilmiş, Ca 2 + toleranslı yetişkin miyositlerde kas uzunluğunun ve Ca2 + geçicilerinin kısalmasını ölçerek gerçekleştirilir. Laboratuvar, bu adım8 için miyositleri sıçan kalplerinden izole etmek için ayrıntılı bir yayınlanmış protokol kullanmaktadır.
Hem Ca2+ geçici hem de miyofilamentler, sağlam miyositlerde kısalmaya ve yeniden uzamaya katkıda bulunur ve kontraktil disfonksiyona katkıda bulunabilir 2,7. Bu nedenle, in vitro fonksiyonel analiz, Ca2+ bisiklet makinesini ve miyofilamentleri içeren sağlam bir miyosit gerektirdiğinde bu yaklaşım önerilir. Örneğin, bozulmamış izole miyositler, gen transferi9 yoluyla miyofilament veya Ca2 + döngü fonksiyonunu değiştirdikten sonra kasılma fonksiyonunu incelemek için arzu edilir. Ek olarak, aşağı akış ikinci haberci sinyal yollarının ve / veya terapötik ajanlara yanıtın etkisini incelerken nörohormonların fonksiyonel etkisini analiz etmek için sağlam bir miyosit yaklaşımı önerilmektedir2. Tek miyositlerde yüke bağlı kuvvetin alternatif bir ölçümü, Ca2 + geçici katkısını ortadan kaldırmak ve miyofilamentfonksiyonuna odaklanmak için en sık düşük sıcaklıklarda (≤15 ° C) membran geçirgenliğinden (veya deriden kaplamadan) sonra gerçekleştirilir. Sağlam miyositlerde yüke bağımlı kuvvet artı Ca2 + geçicilerinin ölçümü, özellikle nörohormon sinyallemesine verilen yanıtları ölçmek veya terapötik ajanlar için bir ekran olarak daha yüksek verime ihtiyaç duyulduğunda, yaklaşım11'in karmaşık ve teknik zorluğu nedeniyle nadirdir. Kardiyak trabeküllerin analizi bu teknik zorlukların üstesinden gelir, ancak miyosit olmayan, fibroz ve / veya hücre dışı matriks yeniden şekillenmesinden de etkilenebilir2. Yukarıda açıklanan yaklaşımların her biri, yetişkin miyositleri içeren bir preparat gerektirir, çünkü yenidoğan miyositleri ve indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen miyositler, yetişkin miyofilament proteinlerinin tam tamamlayıcısını henüz ifade etmemektedir ve genellikle yetişkin çubuk şeklindeki miyosit2'de bulunan miyofilament organizasyon seviyesinden yoksundur. Bugüne kadar, iPSC'lerdeki kanıtlar, yetişkin izoformlarına tam geçişin kültür12'de 134 günden fazla olduğunu göstermektedir.
Bu koleksiyonun HF üzerindeki odağı göz önüne alındığında, protokoller, başarısız olan ve başarısız olmayan sağlam miyositlerdeki kontraktil fonksiyonu ayırt etmek için yaklaşımlar ve analizler içerir. Temsili örnekler, daha önce5,13 olarak tarif edilen, böbrek üstü koarktasyondan 18-20 hafta sonra çalışılan sıçan miyositlerinden verilmiştir. Daha sonra sahte muamele görmüş sıçanlardan miyositlerle karşılaştırmalar yapılır.
Burada tarif edilen protokol ve görüntüleme platformu, HF gelişimi sırasında çubuk şeklindeki kardiyak miyositlerde kısalma ve Ca2+ geçicilerindeki değişiklikleri analiz etmek ve izlemek için kullanılır. Bu analiz için, 2 x 104 Ca2 + toleranslı, çubuk şeklindeki miyositler, 22mm2 laminin kaplı cam kapaklar (CSs) üzerine kaplanır ve daha önce açıklandığı gibi gece boyunca kültürlenir8. Bu görüntüleme platformu için monte edilen bileşenler, optimum görüntüleme için kullanılan ortam ve tamponlarla birlikte, Malzeme Tablosunda verilmiştir. Bir yazılım kullanarak veri analizi için bir kılavuz ve temsili sonuçlar da burada sağlanmaktadır. Genel protokol ayrı alt bölümlere ayrılmıştır, ilk üç bölüm izole sıçan miyositlerine ve veri analizine odaklanır, bunu miyositlerde hücresel Ca2 + geçici deneyler ve veri analizi izler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MEDIA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma (Roche)</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Final concentration = 0.2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-6529</td>
			<td>Final concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td>Final concentration = 15 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-2520</td>
			<td>1 bottle makes 1 L; pH 7.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8875</td>
			<td>Final concentration = 4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 &#956;g/mL streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
			<td>F1221</td>
			<td>50 &#956;g/vial;&#160; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;&#160; Final Fura2-AM concentration in media is&#160; 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenicid</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>P36400</td>
			<td>Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 22&#160; mm2 glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2845-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 x 36 inch cables with banana jacks</td>
			<td>Pomona Electronics</td>
			<td>B-36-2</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37oC Incubator&#160; with 95% O2:5% CO2&#160;</td>
			<td>Forma</td>
			<td>3110</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel E.&#160; Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp</td>
			<td>Forma</td>
			<td>1286</td>
			<td>Multiple models are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 5/45</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1800-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low magnification inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM-IL&#160;</td>
			<td>Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; &#160;4X and 10X objectives recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacing chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Supplemental Figure 1, panel D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ID in Supplemental Figure 2 &#38; Alternatives/Recommended Options</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional components for Ca2+ imaging analysis</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>Essential system components: -- Photon counting system&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Xenon power supply with dual excitation light source&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; --&#160; Fluorescence interface</td>
			<td>&#160;- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera&#160; (panel A #4).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm&#160; excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - The fluorescence interface between the computer and&#160; light source is shown in panel B, #12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera with image acquisition&#160; hardware and software (240 frames/s)</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myocam with CCD controller&#160;</td>
			<td>Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4&#160; and&#160; panel A #5 &#38; panel C #5 (right), respectively.&#160; The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Chamber stimulator</td>
			<td>Ionoptix&#160;</td>
			<td>Myopacer</td>
			<td>Panel B, #13; Alternative:&#160; Grass model S48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip mounted perfusion chamber</td>
			<td>Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws&#160; (arrow, panel F)</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #10 &#38; panel F;&#160;&#160; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).&#160; Commercial alternatives:&#160; Ionoptix FHD or C-stim cell&#160; chambers; Cell MicroControls culture stimulation system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dedicated computer &#38; software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients</td>
			<td>Ionoptix</td>
			<td>PC with Ionwizard PC board and software</td>
			<td>Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric&#160; Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. 
			- A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.&#160; The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5 TI</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Panel F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulated tube holder for media</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
			<td>Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam &#38; a pre-heated gel pack to keep media warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted brightfield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE-2000S</td>
			<td>Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.&#160; &#160;A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolator Table</td>
			<td>TMC Vibration Control</td>
			<td>30 x 36 inches</td>
			<td>Panel A, #1; Desirable:&#160; elevated shelving, Faraday shielding&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope eyepieces &#38; objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective</td>
			<td>Panel A #3; 40X objective:&#160; n.a. 0.08; w.d. 2 mm.&#160; A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;NOTE:&#160; water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>Panel A #8 and panel E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small weigh boat</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>08-732-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Cell MicroControls</td>
			<td>TC2BIP</td>
			<td>Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.&#160;&#160;&#160; A preheater and objective heater are recommended for this platform.&#160; A Cell MicroControls HPRE2 preheater and&#160; HLS-1 objective heater are controlled&#160; by the TC2BIP temperature controller for our studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Under cabinet LED light with motion sensor&#160;</td>
			<td>Sylvania</td>
			<td>#72423 LED light</td>
			<td>Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..&#160; Alternative:&#160; A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask &#38; protective filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Tygon tubing - E363;&#160; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90</td>
			<td>Panel A #11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiac contractile dysfunction and ca2+ transients in rodent myocytes

Kontraktil disfonksiyon ve Ca2+ geçicileri genellikle kardiyak kaynaklı yaralanma ve / veya yeniden modellemenin kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak hücresel düzeyde analiz edilir. Bu fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için bir yaklaşım, primer erişkin kardiyak miyositlerde yüksüz kısaltma ve Ca2+ geçici analizleri kullanır. Bu yaklaşım için, yetişkin miyositler kollajenaz sindirimi ile izole edilir, Ca2 + toleranslı hale getirilir ve daha sonra laminin kaplı kapaklara yapıştırılır, ardından serumsuz ortamlarda elektriksel pacing yapılır. Genel protokol yetişkin sıçan kardiyak miyositlerini kullanır, ancak diğer türlerden birincil miyositler için kolayca ayarlanabilir. Yaralı kalplerden kaynaklanan miyositlerdeki fonksiyonel değişiklikler, sahte miyositler ve / veya in vitro terapötik tedavilerle karşılaştırılabilir. Metodoloji, hücre odası ve platform bileşenleri ile birlikte miyosit pacing için gerekli temel unsurları içerir. Bu yaklaşım için ayrıntılı protokol, sarkomer uzunluğu tespiti ile yüksüz kısalmayı ölçme adımlarını ve oranmetrik gösterge Fura-2 ile ölçülen hücresel Ca2 + geçicileri ve ham veri analizini içerir.

Kontraktil fonksiyon çalışmaları, sıçan miyositleri üzerinde izolasyondan sonraki günden (2. gün) başlayarak izolasyondan 4 gün sonrasına kadar yapılır. Miyositler izolasyondan sonraki gün (yani 2. gün) kaydedilebilse de, gen transferinden veya kasılma fonksiyonunu değiştirmek için tedavilerden sonra genellikle daha uzun kültür sürelerigereklidir 8. İzolasyondan sonra 18 saatten fazla kültürlenen miyositler için, bölüm 1'de açıklanan pacing protokolü, t-tübüllerin...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes at JoVE.com

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

İzole sıçan miyositlerinde kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümü ile birlikte sarkomer uzunluğu tespiti yoluyla kontraktil fonksiyonun ölçümünü tanımlayan bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşımın kalp yetmezliğinin hayvan modellerindeki çalışmalar için uygulanması da dahil edilmiştir.

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Bu yaklaşım, kalp yetmezliğinin gelişimi sırasında kasılma fonksiyonundaki değişiklikleri tespit eder. Miyositlerde nörohormonlara ve potansiyel terapötik ajanlara fonksiyonel yanıt da taranabilir. Miyositin konumlandırılması pratik gerektirebilir, ancak tutarlı sarkomer uzunluğu görüntülemesi elde etmek için gereklidir.Prosedürü gösteren, doçent ve laboratuvarın baş araştırmacısı Margaret Westfall'dur. Deneye başlamadan önce, bir jel paketini ve ortamı bir inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika önceden ısıtın. Makalede belirtildiği gibi kontraktil fonksiyonlu platform bileşenlerini açın ve boruyu peristaltik pompaya monte edin.Ardından, önceden ısıtılmış jel paketini tüp tutucuya aktarın ve güçteki vakumu hücre uyarıcısına açın. Peristaltik pompa borusundan dakikada 0,5 mililitrede perfüzyona başlamak için yalıtımlı tüp tutucusuna ortam içeren 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Daha sonra, küçük bir tartım teknesine iki mililitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve miyositler içeren bir kapak kaymasını stimülasyon odasından tartım teknesine aktarın.Stimülasyon odasını inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte geri getirin. Kapak kaymasını tartım teknesinden çıkarın ve yeni yağlanmış bir kapak kayma odasına aktarmadan ve kapak kaymasına bir damla ortam eklemeden önce alt tarafı nazikçe silin. Kapak kayması üzerine bir platin elektrot montajı yerleştirin, ardından forseps ile üst kısım üzerine yeni bir kapak kayması yerleştirin ve kapak kaymalı sandviçinin üzerine bir üst montaj yeri yerleştirin.Odanın montajını bitirmek için iki veya dört numaralı sıfır panhead vidaları takın. Peristaltik pompada, ortam boru boyunca mevcut olduğunda, boruyu ön ısıtıcıya ve ön ısıtıcıyı kapak kayma odasına takın. Daha sonra, dakikada 0,5 mililitrede perfüzyona başlayın ve sızıntı olmadığından emin olmak için odanın altına bir mendil mendil yerleştirin.Kapak kayma odasını mikroskobun sahne adaptörüne yerleştirdikten sonra, ısıtma sistemini açın ve odanın merkezinde 37 santigrat derece sabit bir ortam sıcaklığı elde etmek için tertibatı beş ila 10 dakika dengeleyin. Perfüze edilmiş ortamın odanın karşı ucunda bir vakum sistemine bağlı boru ile toplandığını gözlemleyin. Dengeleme süresi boyunca, miyositleri mikroskopta 40x suya daldırma hedefi ile görselleştirin.Pacing stimülatörü etkinleştirmek için, voltajı 35 ila 40 volta ayarlayın ve kontraktil fonksiyonu ve miyosit sağkalımını optimize etmek için stimülasyon frekansını 0.2 hertz'e ayarlayın. Sarkomer kısaltma izlerini toplamak için, bilgisayardaki yazılımı açın ve Tamam, dosya ve yeni sekmeleri seçin. İzleri seçerek, kullanıcı sınırlarını ve sarkomer uzunluğunu düzenleyerek bir ekran şablonu hazırlayın.Sarkomer uzunluğu izlerini dosya ve yeni sekmelerle kaydedin, büzülen bir miyositi tanımlayın ve miyositi kameranın uzunlamasına ekseni boyunca konumlandırın, böylece çizgilenme paterni dikey olur. İlgilenilen bölgeyi veya ROI kutusunu miyositin üzerine yerleştirmek için bilgisayar faresini kullanın. Sözleşme işlevini kaydetmek için topla ve başlat'ı seçin.0.5 hertz'lik düşük stimülasyon frekanslarında her miyositten 60 saniye kısalmayı kaydedin. Kapak kayması başına beş ila 10 hücreden sarkomer kısalmasını kaydedin. Bir frekans aralığında kısalmayı ölçmek için, kayıttan önce sabit durum kısalması elde etmek için miyositleri her frekansa yerleştirin.Perfüzyon hızını iki katına çıkarın ve stimülasyondan 15 ila 20 saniye sonra 0.2 ila iki hertz aralığında yeni bir frekansta kayıt yapmaya başlayın ve verilen stimülasyon frekansları aralığında kısaltmak için kapak kayması başına ikiden fazla miyosit kaydetmeyin. Güvenilir sinyal ortalaması verileri elde etmek için hücre başına en az yedi kasılma kaydedin. Dosyayı seçin, kaydedilmiş bir izleme seçin ve ardından Aç'ı seçin.Temel izlemelerden birini seçin ve ardından sarc uzunluğunu elde etmek için izlemenin üstündeki sarı paneli ayarlayın. İşlemler monotonik geçici analiz seçenekleri ve TTL olay işareti ile bir analiz şablonu hazırlayın T Zero tanımında menüden gerekli seçenekler. Şablonları seçerek ve analiz şablonunu bir tanımlayıcıyla kaydederek bu analiz seçeneklerini kaydedin.Her izlemeyi çözümlemeden önce çözümleme şablonunu yükleyin. Verileri analiz etmek için işaretleri, geçidi seçin, geçici ekleyin ve ardından olay işareti ve analiz aralığından dönüştürün. 0,2 hertz'de tempolu miyositler için zaman aralığını eksi 0,01 ila 1,20 saniye arasında ayarlayın.Daha yüksek frekanslarda uyarılan miyositler için daha kısa bir zaman aralığı seçin. Orijinal temel izlemenin altında bir sinyal ortalaması kaydı üretmek için işlemleri ve ortalama olayları seçin. Ardından, sinyal ortalaması alınan izlemeden birini seçin ve ardından üst menüdeki işaretlere gidin ve ardından geçici ekle, işlemleri ve monotonik geçici analizi seçerek sinyal ortalaması alınan ekran panelinde temel sarkomer parametreleri için sinyal ortalaması değerlerini görüntüleyin.Monotonik geçici analizi ve pano akımını dışa aktarmayı seçin ve çoklu miyositlerin kompozit analizi için geçici sarkomer analizini bir elektronik tabloya aktarın. Sinyal ortalaması izlemesini kopyalamak için dışa aktar, geçerli izleme, ardından pano ve seçenekler sekmelerini sırayla seçin ve ondalık basamakları beş olarak ayarlayın. Sekmeler sınırlayıcısını seçin ve Tamam'ı tıklatın.Her miyosit kaydı için sinyal ortalama izlerini ikinci bir elektronik tabloya aktarın. Çalışma, aşırı basınç veya PO'nun, sahte gruba kıyasla miyositlerin kasılma fonksiyonunu azalttığını göstermiştir. Bununla birlikte, kardiyak troponin IT 144D veya cTnIT144D'nin gen transferinden dört gün sonra, PO miyositlerindeki kontraktil yetenek, miyosit fonksiyonunun geri yüklenebileceğini gösteren sahte seviyelere geri döndü.İlk çalışmalarda, cTnIT144D'nin gen transferi, CTnI'ye kıyasla pik kısalmayı ve diyastolik kalsiyum seviyelerini yükseltti. Kardiyak miyositin pozisyonunda ince ayarlamalar genellikle net kısalma izleri elde etmek için gereklidir. Bu protokol, kısalmanın yanı sıra kalsiyum geçicilerini tespit etmek için Fura-2 gibi kalsiyuma duyarlı floresan boyalarla yüklü kardiyak miyositler üzerinde de yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Sıçanlarda sonografik Teknoloji Kullanımı İlaç Kaynaklı Böbrek Hemodinamik Bozukluğu Erken Tespiti

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Tıp

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Rahim içi Telemetri Fare Kontraktil Basıncını Ölçmek<em&gt; İn Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Metabolomik ve Lipidomik Analizler için Beyin Tümörlerinin Yerinde Örnekleme sivesi ve ekstraksiyonu

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

Şiddetli Yumurtalık Disfonksiyonu Olan Hastalarda Doğurganlığın Korunması

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

Bozulmamış Bir Perikard İskemik Kemirgen Modeli

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Rodent Model of The Ross Operation: Syngeneic Pulmonary Artery Graft Implantation in A Systemic Position

Ross Operasyonunun Kemirgen Modeli: Sistemik Pozisyonda Singeneik Pulmoner Arter Greft İmplantasyonu

The Ross operation for aortic valve disease has regained new interest due to its outstanding long-term results. Nonetheless, when employed as freestanding ...