Name: a stably established two-point injection of lysophosphatidylcholine-induced focal demyelination model in mice
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Subventions: 82071380, 81873743).

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut des soins aux animaux du Tongji Medical College, Université des sciences et de la technologie de Huazhong, en Chine. Des souris mâles et femelles adultes C57BL/6 (type sauvage, WT; 20-25 g; 8-10 semaines) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux). Les souris ont été hébergées dans une installation spécifique exempte ...

<ol>
	<li>Gaire, B. P., Choi, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+roles+of+lysophospholipid+receptors+in+activation+of+neuroglia+and+their+neuroinflammatory+responses.">Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).</li><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+-+a+review.">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li><li>Mahad, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination:+A+primary+lipid+disrupting+myelinopathy.">Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy.</a> Glia. 66 (2), 327-347 (2018).</li><li>Nave, K. 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C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum.">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).</li><li>Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuprizone+model+for+demyelination.">The cuprizone model for demyelination.</a> Acta Neurologica Scandinavica. 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La SEP, une maladie démyélinisante chronique du SNC, est l’une des causes les plus fréquentes de dysfonctionnement neurologique chez les jeunes adultesde 20 ans. Cliniquement, environ 60 % à 80 % des patients atteints de SEP connaissent le cycle de rechutes et de rémissions avant de développer une SEP progressive secondaire21,22, et cela conduit finalement à des troubles cumulatifs du mouvement et des déficits cognitifs au fil du...

La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs implique divers processus physiologiques de presque tous les systèmes d’organes1. Dans le système nerveux central (SNC), cette signalisation joue un rôle essentiel dans les pathogenies des maladies neurologiques auto-immunes telles que la sclérose en plaques (SEP). La sclérose en plaques est un trouble chronique à médiation immunitaire caractérisé par une démyélinisation pathologique et une réponse inflammatoire, provoquant un dysfonctionnement neurologique et des troubles cognitifs 2,3. Après une rechute et une rémission continues au début de la maladie, la plupart des patients finissent par passer au stade secondaire-progressif, ce qui pourrait causer des dommages irréversibles au cerveau et une invalidité résultante4. On pense que la caractéristique pathologique de l’évolution secondaire-progressive est les plaques démyélinisantes causées par des lésions inflammatoires5. Les traitements existants de la SP peuvent réduire considérablement le risque de rechute. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement efficace pour les dommages démyélinisants à long terme causés par la SEPprogressive 6. Ainsi, un modèle stable et facilement reproductible est nécessaire pour étudier les thérapies précliniques qui se concentrent sur la dégénérescence de la substance blanche.
La démyélinisation et la remyélinisation sont deux processus pathologiques majeurs dans le développement de la sclérose en plaques. La démyélinisation est la perte de gaine de myéline autour des axones induite par la microglie avec des phénotypes pro-inflammatoires7, et elle conduit à une conduction lente de l’influx nerveux et entraîne la perte de neurones et de troubles neurologiques. La remyélinisation est une réponse de réparation endogène médiée par des oligodendrocytes, où les troubles pourraient entraîner une neurodégénérescence et des troubles cognitifs8. La réponse inflammatoire est cruciale pour l’ensemble du processus, affectant à la fois le degré de lésion de la myéline et la réparation.
Par conséquent, un modèle animal stable de démyélinisation inflammatoire persistante est utile pour explorer plus avant les stratégies thérapeutiques pour la SEP. En raison de la complexité de la SEP, divers types de modèles animaux ont été établis pour imiter les lésions démyélinisantes in vivo, y compris l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), les modèles toxiques-démyélinisants, la cuprizone (CPZ) et la lysophosphatidylcholine (LPC)9 . Le LPC est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Sur la base de rapports précédents et de recherches10,11, un protocole détaillé d’injection en deux points avec quelques modifications est fourni. Généralement, le modèle d’injection LPC classique en un point ne produit qu’une démyélinisation locale au site d’injection et s’accompagne souvent d’une remyélinisation spontanée12,13. Cependant, le modèle LPC à injection en deux points peut démontrer que le LPC peut directement induire une démyélinisation dans le corps calleux de la souris et provoquer une démyélinisation plus durable avec peu de régénération de la myéline.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >L-&#945;-Lysophosphatidylcholine from egg yolk</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4129-25MG</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32 gauge Needle</td>
			<td >HAMILTON</td>
			<td >7762-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 &#956;l syringe</td>
			<td >HAMILTON</td>
			<td >80014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >high speed skull drill</td>
			<td >strong,korea</td>
			<td >strong204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >drill</td>
			<td >Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td >REF 500 104 001 001 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrx Animal Aneathesia Ventilator</td>
			<td >MIDMARK</td>
			<td >VMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Portable Stereotaxic Instrument for Mouse</td>
			<td >Reward</td>
			<td >68507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro syringe</td>
			<td >Reward</td>
			<td >KDS LEGATO 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane&#160;</td>
			<td >VETEASY</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffer</td>
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			<td >PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LuxoL fast bLue</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1030-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture</td>
			<td >FUSUNPHARMA</td>
			<td >20152021225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain mold</td>
			<td >Reward</td>
			<td >68707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Electron microscope fixative</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1102-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.01376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Myelin Basic Protein Antibody&#160;</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >#AB5864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-GST-P pAb</td>
			<td >MBL</td>
			<td >#311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)</td>
			<td >Thermo Fisher&#160;Scientific</td>
			<td >14-5698-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta Actin Monoclonal Antibody</td>
			<td >Proteintech</td>
			<td >66009-1-Ig&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody</td>
			<td >Proteintech</td>
			<td >10458-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OLIG2 Polyclonal Antibody</td>
			<td >Proteintech</td>
			<td >13999-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488&#160;AffiniPure&#160;Donkey anti-Rabbit&#160;IgG (H+L)</td>
			<td >YEASEN</td>
			<td >34206ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td >YEASEN</td>
			<td >34412ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594&#160;AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td >YEASEN</td>
			<td >34212ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td >abclonal</td>
			<td >AS014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td >abclonal</td>
			<td >AS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult C57BL/6 male and female mice</td>
			<td >Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stably established two-point injection of lysophosphatidylcholine-induced focal demyelination model in mice

La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs contribue à la physiopathologie de diverses maladies neurologiques, en particulier la sclérose en plaques (SEP). La lysophosphatidylcholine (LPC) est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Ici, un protocole détaillé est présenté pour l’injection stéréotaxique de LPC en deux points qui pourrait directement provoquer une démyélinisation sévère et reproduire la lésion expérimentale de démyélinisation rapidement et de manière stable chez la souris par une intervention chirurgicale. Ainsi, ce modèle est très pertinent pour les maladies de démyélinisation, en particulier la SEP, et il peut contribuer à l’avancement connexe de la recherche cliniquement pertinente. En outre, l’immunofluorescence et les méthodes de coloration bleue rapide Luxol ont été utilisées pour décrire l’évolution temporelle de la démyélinisation dans le corps calleux de souris injectées avec LPC. En outre, la méthode comportementale a été utilisée pour évaluer la fonction cognitive des souris après modélisation. Dans l’ensemble, l’injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique est une méthode stable et reproductible pour générer un modèle de démyélinisation chez la souris pour une étude plus approfondie.

L’injection en deux points du LPC a entraîné une démyélinisation plus durable Le LPC entraîne principalement des dommages rapides avec toxicité pour la myéline et clivage de l’intégrité de l’axone15. Le jour de l’injection était considéré comme le jour 0. Les souris ont été gardées pendant une période de 10 à 28 jours (10 dpi et 28 dpi). La coloration Luxol fast blue (LFB)10 a été utilisée pour évaluer la zone de démyélinis...

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A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

Le présent protocole décrit une injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique pour générer un modèle de démyélinisation stable et reproductible chez la souris.

Une injection en deux points établie de manière stable de modèle de démyélinisation focale induite par la lysophosphatidylcholine chez la souris

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Notre modèle est très pertinent pour les maladies de démyélinisation, en particulier la sclérose en plaques. Et cela peut contribuer à l’avancement de la recherche cliniquement pertinente connexe. C’est un protocole détaillé qui pourrait directement causer une démyélinisation sévère rapidement et de manière stable chez la souris par intervention chirurgicale.Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, soyez patient et assurez-vous que les coordonnées sont précises. Commencez par connecter une aiguille de calibre 32 à une seringue de 5 microlitres. Retirer 5 microlitres de solution LPC pour la préparation de l’injection.Ensuite, confirmez la profondeur de l’anesthésie de la souris par l’absence de réflexe de pincement des orteils pendant que la respiration est douce. Placez la souris dans le cadre stéréotaxique avec la face dorsale vers le haut et fixez la tête avec un cône nasal et une pince dentaire. Fixez la souris à l’appareil stéréotaxique avec des barres d’oreille bilatérales.Assurez-vous que les barres d’oreille sont de niveau et que la tête est horizontale et stable. Désinfectez la peau de la tête en essuyant avec de l’iodophor. Ensuite, utilisez un scalpel pour couper une petite incision à environ 1,5 centimètre le long de la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne.Essuyez la compétence avec un coton-tige trempé dans du peroxyde d’hydrogène à 1% jusqu’à ce que le bregma, le lambda et la fontanelle postérieure soient exposés. Placez la seringue sur l’appareil stéréotaxique. Assurez-vous du positionnement horizontal de la tête de l’animal et localisez le corps calleux.Une fois le site d’injection déterminé, notez les coordonnées et faites une marque avec un marqueur sur le crâne. Percez doucement le site marqué avec une perceuse à crâne. Prenez soin d’éviter tout saignement.Déplacez lentement l’aiguille jusqu’aux coordonnées données. Pour induire la démyélinisation du corps calleux, injecter 2 microlitres de solution de PLC à chaque site d’injection à raison de 0,4 microlitre par minute. Après l’injection, gardez l’aiguille dans chaque site pendant 10 minutes supplémentaires.Enfin, suturez la peau avec une suture 4-0 et attendez que l’animal se réveille dans les 10 minutes. L’image représentative montre la détection des légions de substance blanche via la coloration bleue rapide Luxol. D’après les résultats, une démyélinisation stable du corps calleux peut être observée 10 et 28 jours après l’injection.La quantification de la zone de démyélinisation à différents moments est présentée ici. Grâce à la coloration par immunofluorescence de la protéine basique dégradée de la myéline, une augmentation remarquable du dMBP a été observée dans le groupe injecté par LPC 10 jours après l’injection, ce qui représente une perte de myéline dans le corps calleux. L’analyse par transfert Western de l’expression de la protéine basique de la myéline, ou MBP, a montré une perte significative de MBP après injection de LPC.La bêta-actine a été utilisée comme contrôle de charge pour mesurer l’expression de base. Les images de microscopie électronique confirment l’ultrastructure myélinisée dans le corps calleux du groupe simulé et du groupe injecté par LPC. GST-pi est le marqueur de la maturation de la différenciation des cellules précurseurs d’oligodendrocytes, ou OPC.Après 10 jours d’injection de PLC, le GST-pi a diminué par rapport au groupe fictif. Dans le même temps, la capacité de prolifération des oligodendrocytes peut être reflétée par le rapport entre la prolifération des oligodendrocytes et le nombre total de cellules de la lignée oligodendrocytes. Le rapport plus élevé représente une plus grande prolifération d’oligodendrocytes après 10 jours après l’injection.Les images représentatives montrent le parcours de nage des souris dans chaque groupe, en présence de la plate-forme et après avoir retiré la plate-forme. Les résultats suggèrent que la mémoire spatiale des souris démyélinisées est significativement altérée dans le modèle d’injection LPC à deux points. Tout en essayant cette procédure, assurez-vous que le taux d’injection est précis et gardez l’aiguille dans chaque site pendant 10 minutes supplémentaires.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Focale modèle d&#39;ischémie cérébrale par occlusion suture endovasculaire de l&#39;artère cérébrale moyenne chez le rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Recherche

Neurosciences

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Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
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accounts for 10-15% ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibiteur formation des synapses dans une co-culture modèle intégrant GABAergiques moyennes épineux neurones et les cellules HEK293 exprimant de façon stable GABA<sub&gt; A</sub&gt; Récepteurs

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Expérimental démyélinisation et la remyélinisation de la moelle épinière murin par injection focale de lysolécithine

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