Name: a stably established two-point injection of lysophosphatidylcholine-induced focal demyelination model in mice
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones: 82071380, 81873743).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado Animal del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, China. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras adultos C57BL/6 (tipo salvaje, WT; 20-25 g; 8-10 semanas de edad). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). Los ratones fueron alojados en una instalación animal específica libre de patógenos (SPF) con agua y alimentos <...

<ol>
	<li>Gaire, B. P., Choi, J. 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C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum.">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).</li><li>Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cuprizone+model+for+demyelination.">The cuprizone model for demyelination.</a> Acta Neurologica Scandinavica. 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La EM, una enfermedad desmielinizante crónica del SNC, es una de las causas más comunes de disfunción neurológica en adultos jóvenes20. Clínicamente, aproximadamente el 60%-80% de los pacientes con EM experimentan el ciclo de recaídas y remisiones antes de desarrollar una EM secundaria-progresiva21,22, y eventualmente conduce a deficiencias acumulativas del movimiento y déficits cognitivos a lo largo del tiempo23<...

La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores implica diversos procesos fisiológicos de casi todos los sistemas de órganos1. En el sistema nervioso central (SNC), esta señalización juega un papel crítico en las patogenicidades de enfermedades neurológicas autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple es un trastorno crónico inmunomediado caracterizado por desmielinización patológica y respuesta inflamatoria, causando disfunción neurológica y deterioro cognitivo 2,3. Después de continuas recaídas y remisiones durante la enfermedad temprana, la mayoría de los pacientes eventualmente progresan a la etapa secundaria-progresiva, lo que podría causar daños irreversibles en el cerebro y la discapacidad resultante4. Se cree que el sello patológico del curso secundario-progresivo son las placas desmielinizantes causadas por lesiones inflamatorias5. Los tratamientos existentes para la EM pueden reducir significativamente el riesgo de recaída. Sin embargo, todavía no existe una terapia efectiva para el daño desmielinizante a largo plazo causado por la EMprogresiva 6. Por lo tanto, se requiere un modelo estable y fácilmente reproducible para estudiar terapias preclínicas que se centren en la degeneración de la materia blanca.
La desmielinización y la remielinización son dos procesos patológicos principales en el desarrollo de la esclerosis múltiple. La desmielinización es la pérdida de vaina de mielina alrededor de los axones inducida por la microglía con fenotipos proinflamatorios7, y conduce a una conducción lenta de los impulsos nerviosos y resulta en la pérdida de neuronas y trastornos neurológicos. La remielinización es una respuesta de reparación endógena mediada por oligodendrocitos, donde los trastornos podrían conducir a la neurodegeneración y al deterioro cognitivo8. La respuesta inflamatoria es crucial para todo el proceso, afectando tanto el grado de daño como la reparación de la mielina.
Por lo tanto, un modelo animal estable de desmielinización inflamatoria persistente es significativo para una mayor exploración de estrategias terapéuticas para la EM. Debido a la complejidad de la EM, se han establecido varios tipos de modelos animales para imitar lesiones desmielinizantes in vivo, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), modelos tóxico-desmielinizantes, cuprizona (CPZ) y lisofosfatidilcolina (LPC)9 . LPC es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Sobre la base de informes previos einvestigaciones 10,11, se proporciona un protocolo detallado de inyección de dos puntos con algunas modificaciones. Generalmente, el modelo clásico de inyección de LPC de un punto solo produce desmielinización local en el sitio de inyección y a menudo se acompaña de remielinización espontánea12,13. Sin embargo, el modelo LPC de inyección de dos puntos puede demostrar que el LPC puede inducir directamente la desmielinización en el cuerpo calloso del ratón y causar una desmielinización más duradera con poca regeneración de mielina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >L-&#945;-Lysophosphatidylcholine from egg yolk</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4129-25MG</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32 gauge Needle</td>
			<td >HAMILTON</td>
			<td >7762-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 &#956;l syringe</td>
			<td >HAMILTON</td>
			<td >80014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >high speed skull drill</td>
			<td >strong,korea</td>
			<td >strong204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >drill</td>
			<td >Hager &#38; Meisinger, Germany&#160;</td>
			<td >REF 500 104 001 001 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Matrx Animal Aneathesia Ventilator</td>
			<td >MIDMARK</td>
			<td >VMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Portable Stereotaxic Instrument for Mouse</td>
			<td >Reward</td>
			<td >68507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro syringe</td>
			<td >Reward</td>
			<td >KDS LEGATO 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane&#160;</td>
			<td >VETEASY</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffer</td>
			<td >BOSTER</td>
			<td >PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LuxoL fast bLue</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1030-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture</td>
			<td >FUSUNPHARMA</td>
			<td >20152021225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain mold</td>
			<td >Reward</td>
			<td >68707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Electron microscope fixative</td>
			<td >Servicebio</td>
			<td >G1102-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.01376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-Myelin Basic Protein Antibody&#160;</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >#AB5864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-GST-P pAb</td>
			<td >MBL</td>
			<td >#311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15)</td>
			<td >Thermo Fisher&#160;Scientific</td>
			<td >14-5698-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Beta Actin Monoclonal Antibody</td>
			<td >Proteintech</td>
			<td >66009-1-Ig&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody</td>
			<td >Proteintech</td>
			<td >10458-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OLIG2 Polyclonal Antibody</td>
			<td >Proteintech</td>
			<td >13999-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 488&#160;AffiniPure&#160;Donkey anti-Rabbit&#160;IgG (H+L)</td>
			<td >YEASEN</td>
			<td >34206ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td >YEASEN</td>
			<td >34412ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 594&#160;AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td >YEASEN</td>
			<td >34212ES60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td >abclonal</td>
			<td >AS014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td >abclonal</td>
			<td >AS003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult C57BL/6 male and female mice</td>
			<td >Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a stably established two-point injection of lysophosphatidylcholine-induced focal demyelination model in mice

La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores contribuye a la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas, especialmente la esclerosis múltiple (EM). La lisofosfatidilcolina (LPC) es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la inyección estereotáctica de LPC de dos puntos que podría causar directamente una desmielinización severa y replicar la lesión experimental de desmielinización de forma rápida y estable en ratones mediante procedimiento quirúrgico. Por lo tanto, este modelo es altamente relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la EM, y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Además, se utilizaron métodos de inmunofluorescencia y tinción azul rápida Luxol para representar el curso temporal de la desmielinización en el cuerpo calloso de ratones inyectados con LPC. Además, se utilizó el método conductual para evaluar la función cognitiva de los ratones después del modelado. En general, la inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico es un método estable y reproducible para generar un modelo de desmielinización en ratones para su posterior estudio.

La inyección de dos puntos del LPC resultó en una desmielinización más duradera LpC conduce principalmente a un daño rápido con toxicidad a la mielina y escisión de la integridad del axón15. El día de la inyección se consideró como el día 0. Los ratones se mantuvieron durante un período de 10-28 días (10 dpi y 28 dpi). La tinción Luxol fast blue (LFB)10 se utilizó para evaluar el área de desmielinización en ratones en estos puntos tempo...

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A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

El presente protocolo describe una inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico para generar un modelo de desmielinización estable y reproducible en ratones.

Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Nuestro modelo es muy relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la esclerosis múltiple. Y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Es un protocolo detallado que podría causar directamente una desmielinización severa de forma rápida y estable en ratones mediante un procedimiento quirúrgico.Al probar esta técnica por primera vez, sea paciente y asegúrese de que las coordenadas sean precisas. Comience conectando una aguja de calibre 32 a una jeringa de 5 microlitros. Extraiga 5 microlitros de solución LPC para la preparación de la inyección.A continuación, confirme la profundidad de la anestesia del ratón por la falta de reflejo de pellizco del dedo del pie mientras la respiración es suave. Coloque el ratón en el marco estereotáxico con el lado dorsal hacia arriba y asegure la cabeza con un cono nasal y una pinza dental. Fije el ratón al aparato estereotáxico con barras auriculares bilaterales.Asegúrese de que las barras para los oídos estén niveladas y que la cabeza esté horizontal y estable. Desinfecte la piel de la cabeza limpiando con yodóforo. Luego use bisturí para cortar una pequeña incisión a aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.Limpie la habilidad con un hisopo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno al 1% hasta que el bregma, lambda y la fontanela posterior estén expuestos. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxico. Asegurar la posición horizontal de la cabeza del animal, y localizar el cuerpo calloso.Una vez que se determine el sitio de inyección, registre las coordenadas y haga una marca con un marcador en el cráneo. Perfore suavemente el sitio marcado con un taladro de cráneo. Tenga cuidado de evitar cualquier sangrado.Mueva lentamente la aguja a las coordenadas dadas. Para inducir la desmielinización del cuerpo calloso, inyecte 2 microlitros de solución LPC en cada sitio de inyección a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto. Después de la inyección, mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.Finalmente, suture la piel con una sutura 4-0 y espere a que el animal se despierte en 10 minutos. La imagen representativa muestra la detección de las legiones de materia blanca a través de la tinción azul rápida de Luxol. A partir de los resultados, se puede observar una desmielinización estable del cuerpo calloso a los 10 y 28 días después de la inyección.La cuantificación del área de desmielinización en diferentes puntos de tiempo se muestra aquí. A través de la tinción de inmunofluorescencia degradó la proteína básica de mielina, se observó un aumento notable de dMBP en el grupo inyectado LPC a los 10 días después de la inyección, lo que representa la pérdida de mielina en el cuerpo calloso. El análisis de Western blot de la expresión de la proteína básica de mielina, o MBP, mostró una pérdida significativa de MBP después de la inyección de LPC.La beta-actina se utilizó como control de carga para medir la expresión basal. Las imágenes de microscopía electrónica confirman la ultraestructura mielinizada en el cuerpo calloso del grupo simulado y el grupo inyectado LPC. GST-pi es el marcador de la maduración de la diferenciación de la célula precursora de oligodendrocitos, u OPC.Después de 10 días de inyección de LPC, el GST-pi disminuyó en comparación con el grupo simulado. Al mismo tiempo, la capacidad de proliferación de los oligodendrocitos puede reflejarse en la proporción de oligodendrocitos proliferan y las células de linaje de oligodendrocitos totales. La proporción más alta representa una mayor proliferación de oligodendrocitos después de 10 días después de la inyección.Las imágenes representativas muestran la trayectoria de natación de los ratones en cada grupo, en presencia de la plataforma y después de retirar la plataforma. Los resultados sugieren que la memoria espacial de los ratones desmielinizados se ve significativamente afectada en el modelo de inyección LPC de dos puntos. Mientras intenta este procedimiento, asegúrese de que la velocidad de inyección sea precisa y mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Modelo de isquemia cerebral focal por oclusión endovascular de sutura de la arteria cerebral media en la rata

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Investigación

Neurociencias

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

La formación de sinapsis inhibitorias en una Co-cultura modelo que incorpora GABAérgicas Mediano espinosas neuronas y células HEK293 que expresan establemente GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptores

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

Grabación de potencial evocado visual en un modelo de rata de Experimental del Nervio Óptico Desmielinización

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Transección parcial del nervio óptico en ratas: un modelo con un nuevo enfoque operativo para evaluar la degeneración secundaria de las células ganglionares de la retina

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citoquinas proinflamatorias

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Un modelo de rata de la infección cerebral EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...