Name: use of bisection to reduce mitochondrial dna in the bovine oocyte
Uploaded: 2022-07-06T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte at JoVE.com

Les auteurs souhaitent remercier leurs collègues de l’Université d’État de l’Utah, les chercheurs en sciences de la reproduction du zoo de San Diego et le Dr Rebecca Krisher du genre PLC.

Le protocole suivant suit les directives en matière de soins aux animaux et d’éthique fournies par l’Université d’État de l’Utah.
1. Préparation des médias
<ol><li>Avant la manipulation des ovocytes, préparer les solutions suivantes, comme décrit dans le tableau 1 : 400 μL de solution de hyaluronidase, 500 μL de milieu T2, 1 020 μL de milieu T20 et 800 μL de milieu T10.</li>
	<li>Divisez le milieu T10 en deux puits d’une plaque de quatr...

<ol>
	<li>Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer:+A+salvage+tool+seeking+first+aid.">Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid.</a> Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).</li><li>Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+cloned+Bactrian+camel+(camelus+bactrianus)+calf+produced+by+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer:+A+step+towards+preserving+the+critically+endangered+wild+Bactrian+camels.">First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels.</a> PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).</li><li>Oh, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+endangered+gray+wolves+(canis+lupus)+from+somatic+cells+collected+postmortem.">Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem.</a> Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).</li><li>Srirattana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+gaur-bovine+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+embryos:+Effect+of+trichostatin+a+treatment.">Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment.</a> Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).</li><li>Kwon, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+adult+fibroblasts+of+a+rhesus+monkey+(macaca+mulatta)+using+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer.">Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer.</a> Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+cloned+sei+whale+(Balaenoptera+borealis)+embryos+by+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+using+enucleated+pig+oocytes.">Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes.</a> Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).</li><li>Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+interspecies+cloned+monkey+embryos+reconstructed+with+bovine+enucleated+oocytes.">Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).</li><li>Hong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+transgenic+canine+embryos+using+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer.">Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer.</a> Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+Implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+transmission+and+confounding+mitochondrial+influences+in+cloned+cattle+and+pigs.">Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs.</a> Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).</li><li>Lanza, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+an+endangered+species+(Bos+Gaurus)+using+interspecies+nuclear+transfer.">Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer.</a> Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).</li><li>Evans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+genotypes+in+nuclear+transfer-derived+cloned+sheep.">Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep.</a> Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).</li><li>Meirelles, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+replacement+of+the+mitochondrial+genotype+in+a+Bos+indicus+calf+reconstructed+by+nuclear+transfer+to+a+Bos+taurus+oocyte.">Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte.</a> Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).</li><li>Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+nuclear+transfer:+Implications+for+embryonic+stem+cell+biology.">Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).</li><li>Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer:+advancements+and+problems.">Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+is+dependent+on+compatible+mitochondrial+DNA+and+reprogramming+factors.">Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors.</a> PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).</li><li>Chiaratti, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+mitochondrial+DNA+depletion+is+reversed+during+early+embryogenesis+in+cattle.">Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).</li><li>Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+mitochondrial+DNA+replication+during+oocyte+maturation+is+essential+for+successful+porcine+embryonic+development.">Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development.</a> Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).</li><li>Cagnone, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+normal+embryogenesis+by+mitochondrial+supplementation+in+pig+oocytes+exhibiting+mitochondrial+DNA+deficiency.">Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).</li><li>Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+mitochondrial+DNA+replication+during+oocyte+maturation+is+essential+for+successful+porcine+embryonic+development.">Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development.</a> Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).</li><li>Ferreira, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+supplementation+with+mitochondria+improve+oocyte+competence?+A+systematic+review.">Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review.</a> Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).</li><li>Bhat, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+birth+of+a+pashmina+goat+kid+after+transfer+of+handmade+cloned+embryos.">Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos.</a> Journal of Reproduction and Development. , (2019).</li><li>Tecirlioglu, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+cloned+calf+derived+from+a+vitrified+hand-made+cloned+embryo.">Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo.</a> Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handmade+cloned+transgenic+piglets+expressing+the+nematode+fat-1+gene.">Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene.</a> Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handmade+cloned+transgenic+sheep+rich+in+omega-3+fatty+acids.">Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids.</a> PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).</li><li>Lagutina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+nuclear+transfer+in+horses:+Effect+of+oocyte+morphology,+embryo+reconstruction+method+and+donor+cell+type.">Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type.</a> Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).</li><li>Chiaratti, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+mitochondrial+DNA+depletion+is+reversed+during+early+embryogenesis+in+cattle.">Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).</li><li>Hosseini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+efficient+method+of+manual+oocyte+enucleation+using+a+pulled+pasteur+pipette.">and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).</li><li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+(danio+rerio)+oocytes.">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li><li>International Union for Conservation of Nature. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IUCN+Red+List+of+Threatened+Species.">The IUCN Red List of Threatened Species.</a> International Union for Conservation of Nature. , (2021).</li><li>Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+deer+cloned+from+antler+stem+cells+and+their+differentiated+progeny.">Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny.</a> Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).</li><li>G&#243;mez, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+African+wildcat+cloned+kittens+born+from+domestic+cats.">Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats.</a> Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).</li><li>Lanza, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+an+endangered+species+(Bos+gaurus)+using+interspecies+nuclear+transfer.">Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer.</a> Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).</li></ol>

Les méthodes précédemment utilisées pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt dans les ovocytes ont leurs inconvénients respectifs. L’élimination des mitochondries des ovocytes par micromanipulation diminue le nombre de copies d’ADNmt de 64 % en moyenne27. Une méthode unique, précédemment utilisée pour l’énucléation, implique l’utilisation de pipettes Pasteur de petit diamètre et la division d’un ovocyte sans zone pellucide à la frontière entre une microgoutte de milieu ...

Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) comprend la fusion d’un ovocyte énucléé d’un animal et d’une cellule somatique d’un animal de la même espèce. Dans la plupart des cas, l’ovocyte et la cellule somatique proviennent de la même espèce et les taux de naissances vivantes sont inférieurs à 6 %1. Certaines recherches impliquent l’utilisation de SCNT interespèces (iSCNT), qui comprend la fusion d’une cellule somatique et d’un ovocyte provenant de deux espèces différentes. Dans ces études, les taux de naissances vivantes sont encore plus bas que dans le SCNT - généralement inférieur à 1%1. Cependant, l’iSCNT a la capacité d’être utilisé comme méthode de sauvetage d’espèces menacées, car les cellules somatiques de ces animaux sont plus accessibles que leurs cellules germinales1. Les ovocytes receveurs utilisés dans l’iSCNT sont souvent des espèces de laboratoire domestiques ou communes, telles que les vaches, les porcs et les souris. Certaines tentatives faites jusqu’à présent ont réussi à produire des jeunes vivants, bien que la progéniture produite ait été des animaux intragénériques (les espèces d’ovocytes receveurs et les espèces de cellules donneuses étaient membres du même genre)2,3,4. Les modèles intergénériques (qui utilisent un ovocyte et une cellule somatique d’animaux de différents genres) n’ont pas encore produit d’animaux vivants, et la majorité des embryons reconstruits s’arrêtent au stade 8-16 cellules du développement in vitro 5,6,7,8. Une explication possible de cet arrêt du développement embryonnaire est l’apparition d’une hétéroplasmie mitochondriale dans les embryons - la présence de plus d’un type d’ADN mitochondrial (ADNmt) dans une seule cellule. L’hétéroplasmie peut entraîner des problèmes tels que l’inefficacité du développement ou l’échec de l’embryon ou de l’animal vivant1. La pathogenèse peut également survenir plus tard dans la vie de l’animal9. Bien que ce problème soit également présent chez la progéniture SCNT, la composante interspécifique des embryons iSCNT exacerbe le problème.
Lorsque l’ADNmt embryonnaire provient de deux espèces différentes, les mitochondries ovocytaires receveuses, qui représentent la majorité, ne fonctionnent pas efficacement avec le noyau1,10 de la cellule donneuse. Des écarts taxonomiques plus importants entre les deux espèces utilisées dans l’iSCNT intensifient probablement ce problème; La progéniture vivante intragénérique produite (progéniture Bos gaurus et Bos indicus utilisant les ovocytes Bos taurus), ainsi que la progéniture produite via la SCNT traditionnelle (par exemple, la progéniture Ovis aries utilisant des ovocytes Ovis aries) se sont révélées être des chimères (l’ADNmt de deux individus était présent chez ces animaux 11,12,13). Pourtant, ils se sont développés beaucoup plus loin que les embryons SCNT intergénériques14,15. L’échange d’informations entre les mitochondries de l’ovocyte et le noyau de la cellule donneuse pourrait être plus efficace dans l’embryon intragénérique que dans l’embryon intergénérique16.
La quantité d’ADNmt dans un ovocyte bovin mature est environ 100 fois supérieure à la quantité trouvée dans une cellule somatique12. La réduction de ce ratio pourrait encourager les mitochondries des cellules somatiques à proliférer dans l’embryon reconstruit, ce qui permettrait à une plus grande population de mitochondries productives d’être présente16. Cela pourrait à son tour fournir plus d’énergie pour répondre aux besoins de l’embryonen développement 15. Les tentatives précédentes faites pour réduire le nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte ou de l’embryon comprennent l’application chimique, la micromanipulation et la supplémentation de l’ovocyte ou de l’embryon avec des mitochondries supplémentaires de l’espèce de cellule donneuse 16,17,18,19,20. Cependant, l’application chimique (comme la 2',3'-didéoxycytidine) n’est pas idéale pour le développement embryonnaire et a réduit le nombre de copies d’ADNmt ovocyte d’environ la moitiéde 18. La réduction antérieure de l’ADNmt ovocyte par micromanipulation n’a éliminé en moyenne que 64% de l’ADNmt17 de l’ovocyte. Bien que la supplémentation en mitochondries de cellules donneuses puisse être une option viable, son utilisation n’a pas encore produit d’animal intergénérique vivant dans les études iSCNT21.
L’utilisation de la bisection pour réduire le nombre de copies de l’ADNmt ovocyte n’a pas encore été utilisée dans les études publiées. La coupe en deux des ovocytes dans l’intention de fusionner les ooplastes avec une cellule somatique est la prémisse du clonage fait à la main (HMC), qui utilise généralement la bisection comme méthode pour éliminer le corps polaire et la plaque de métaphase de l’ovocyte de métaphase II (MII). HMC a produit avec succès une progéniture chez plusieurs espèces, y compris les chèvres, les bovins, les porcs, les moutons et les chevaux 22,23,24,25,26, mais n’inclut généralement pas d’étape de centrifugation avant la bisection. L’intégration de la centrifugation à grande vitesse de l’ovocyte permet l’isolement des mitochondries (et donc de l’ADNmt) à un pôle de l’ovocyte, qui peut ensuite être coupé en deux à l’aide d’une microlame pour éliminer ces fractions denses en mitochondries. Deux ooplastes appauvris en mitochondries peuvent ensuite être fusionnés avec une cellule somatique, comme c’est le cas dans le HMC, pour former un embryon reconstruit qui contient beaucoup moins d’ADNmt de l’espèce ovocytaire.
La question à laquelle nous tentons de répondre avec ce protocole est de savoir comment réduire l’ADNmt dans l’ovocyte bovin afin de produire un embryon reconstruit viable qui contient moins d’ADNmt hétéroplasmique. Dans ce protocole, les ovocytes ont été centrifugés et coupés en deux. Le nombre de copies d’ooplast et d’ADNmt ovocytaire intact a été calculé pour déterminer l’efficacité de cette technique dans la réduction du nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte bovin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>D1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtDNA Primer: Forward (12S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGGCTACATTCTCTACACCAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mtDNA Primer: Reverse (12S)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle</td>
			<td>PFM Medical</td>
			<td>207300633</td>
			<td>Microblade for bisection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio&#8482; 3 - 96-Well 0.2-mL</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A28567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Search plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>K0221</td>
			<td>qPCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoPlate</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TPi-SMZSSX</td>
			<td>Heating stage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of bisection to reduce mitochondrial dna in the bovine oocyte

Le transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces (iSCNT) peut être utilisé pour sauver des espèces menacées, mais deux populations distinctes d’ADN mitochondrial (ADNmt) existent dans l’embryon reconstruit : une dans l’ooplasme receveur et une dans la cellule somatique donneuse. Cette hétéroplasmie mitochondriale peut entraîner des problèmes de développement chez l’embryon et le fœtus. Les protocoles de clonage faits à la main comprennent la bisection ovocytaire, qui peut être utilisée pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt, réduisant ainsi le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit. La centrifugation d’ovocytes bovins matures et dénudés a produit une fraction visible dense en mitochondries à un pôle de l’ovocyte. Les pellucidés de la zone des ovocytes ont été éliminés par exposition à une solution de pronase. La bisection a été réalisée à l’aide d’une microlame pour éliminer la fraction visible des mitochondries. La qPCR a été utilisée pour quantifier l’ADNmt présent dans les échantillons d’ADN extraits d’ovocytes entiers et d’ooplastes coupés en deux, fournissant une comparaison des nombres de copies d’ADNmt avant et après la bisection. Les nombres de copies ont été calculés à l’aide de valeurs seuils de cycle, de la formule de la ligne de régression d’une courbe standard et d’un ratio qui comprenait les tailles respectives des produits de PCR d’ADNmt et des produits de PCR génomique. Un ovocyte bovin avait un nombre moyen de copies d’ADNmt (± écart-type) de 137 904 ± 94 768 (n = 38). Un ooplast appauvri en mitochondries avait un nombre moyen de copies d’ADNmt de 8 442 ± 13 806 (n = 33). Les copies moyennes d’ADNmt présentes dans un ooplast riche en mitochondries étaient de 79 390 ± de 58 526 copies d’ADNmt (n = 28). Les différences entre ces moyennes calculées indiquent que la centrifugation et la bisection subséquente peuvent diminuer considérablement le nombre de copies d’ADNmt présent dans l’ooplaste appauvri en mitochondries par rapport à l’ovocyte d’origine (P < 0,0001, déterminé par une ANOVA unidirectionnelle). La réduction de l’ADNmt devrait diminuer le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit, favorisant éventuellement le développement embryonnaire et fœtal standard. La supplémentation en extrait mitochondrial de la cellule donneuse somatique peut également être essentielle pour réussir le développement embryonnaire.

Les résultats quantitatifs de la PCR (qPCR) sont utilisés pour déterminer les quantités relatives d’ADNmt présentes dans chaque ooplaste. La réaction décrite est conçue pour amplifier la région 12S de l’ADNmt bovin.
Si la bisection a réussi, les échantillons d’ovocytes entiers et d’ooplastes denses en mitochondries auront des valeurs Ct similaires. Les échantillons d’ooplastes réduits aux mitochondries auront des valeurs de Ct plus élevées que les...

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Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte

Ici, nous présentons un protocole pour réduire significativement le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans un ovocyte bovin (P < 0,0001). Cette méthode utilise la centrifugation et la bisection pour réduire considérablement les mitochondries des ovocytes et peut permettre d’augmenter les chances de développement dans les embryons de transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces reconstruits.

Utilisation de la bisection pour réduire l’ADN mitochondrial dans l’ovocyte bovin

Interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) may be used to rescue endangered species, but two distinct populations of mitochondrial DNA (mtDNA) ...

Le protocole réduit considérablement le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans l’ovocyte. Cela pourrait être bénéfique pour le clonage intra-espèce. Cette méthode réduit le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans les ovocytes bovins de plus de 90%, ce qui pourrait réduire l’incidence de l’hétéroplasmie mitochondriale dans les embryons clonés.Laura Adams, une doctorante de mon laboratoire, fera une démonstration de la procédure. Pour commencer, à l’aide d’une pipette, prélever les ovocytes matures sélectionnés dans la goutte de HSOF et les placer dans le tube de 1,5 millilitre contenant 50 microlitres de la solution de HSOF CB. Centrifuger les ovocytes à 15 000 fois G pendant 12 minutes.Pendant que les ovocytes sont en cours de centrifugation, préparez la plaque de bisection. Pour cela, commencez par faire un motif sur le couvercle d’une boîte de Petri de 60 millimètres en utilisant 20 microlitres par goutte, et couvrez entièrement les gouttes avec de l’huile minérale. À l’aide d’un marqueur à pointe mince, marquez les lignes sous le plat.Couvrir le plat avec un couvercle opaque jusqu’à ce que la centrifugation soit terminée pour éviter les changements d’osmolarité des microgouttes. Dès que la centrifugation est terminée, utilisez une pipette de 200 microlitres pour recueillir les ovocytes dans la solution et déplacez-les dans une partie vide d’une nouvelle plaque de recherche avec quatre gouttes HSOF de 400 microlitres, avant de laver les ovocytes à travers des gouttes HSOF. Allumez l’étage de chauffage à 38,5 degrés Celsius.Utilisez une pipette buccale pour déplacer les ovocytes centrifugés de la goutte HSOF vers la goutte T2 supérieure gauche de la plaque de bisection. Ensuite, lavez les ovocytes à travers les trois gouttes suivantes sur la rangée supérieure. Déposez les ovocytes dans l’une des gouttes de pronase, en assurant qu’il y a peu ou pas de contact entre eux.Observez les ovocytes jusqu’à ce qu’il y ait une déformation claire des zonae pellucidae. Une fois qu’une seule zone ovocytaire pellucide s’est déformée, déplacez cet ovocyte vers la goutte T2 voisine. Répétez l’opération lorsque d’autres ovocytes se déforment, jusqu’à ce que tous les ovocytes aient été retirés de la pronase et placés dans la goutte de T2.Observez les ovocytes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une fine couche de la zone pellucide. Lavez les ovocytes à travers les trois gouttes suivantes dans la rangée, puis déposez-les en lignes verticales dans les gouttes CBT20. Commencez avec moins d’ovocytes dans les lignes verticales et augmentez le nombre d’ovocytes par goutte à mesure que les compétences de bisection progressent.Concentrez-vous sur la première goutte CBT20 la plus à gauche qui contient des ovocytes et utilisez une pipette buccale pour faire pivoter les ovocytes de sorte que la partie dense en mitochondries de chaque ovocyte soit tournée vers ou loin du bras du microscope. Placez la pointe de la microlame à gauche de l’ovocyte supérieur, en ligne avec l’espace directement au-dessus de la partie dense en mitochondries. En gardant l’extrémité de la lame au même endroit, abaissez soigneusement la lame pour la couper tout au long de l’ovocyte.Assurez-vous que l’ooplast dense en mitochondries et l’ooplast réduit en mitochondries sont de la même taille et que la lame est coupée en deux dans le segment le plus clair de l’ovocyte centrifugé. Lorsque vous soulevez la lame, assurez-vous que la même ligne est maintenue et que la pointe de la lame reste au même endroit, puis soulevez doucement la pointe de la plaque. Répétez les étapes de bisection pour tous les ovocytes dans la première goutte de bisection.Si des ovocytes sont présents dans des gouttes supplémentaires, orientez et coupez en deux les ovocytes restants. À l’aide d’une pipette buccale, recueillir les ooplastes réduits en mitochondries de la première goutte de bisection. Placez-les dans la goutte T20 de gauche située dans la rangée inférieure de la plaque.Répétez l’opération pour toutes les gouttes de bisection restantes. À l’aide d’une pipette buccale, recueillir les ooplastes denses des mitochondries de la première goutte de bisection. Placez-les dans la goutte T20 de droite située dans la rangée inférieure de la plaque.Répétez l’opération pour toutes les gouttes de bisection restantes. Récupérez la boîte à quatre puits T10 de l’incubateur. À l’aide d’une pipette buccale, déplacez tous les ooplastes réduits en mitochondries vers le MR bien étiqueté et déplacez les ooplastes denses en mitochondries vers le M.Replacez la plaque à quatre puits dans l’incubateur contrôlé par le dioxyde de carbone.Laisser les ooplastes reposer pendant au moins 30 minutes avant la quantification de l’ADNmt. Pour une bisection réussie, les échantillons d’ovocytes entiers et d’ooplastes denses en mitochondries ont des valeurs de tomodensitométrie similaires. Les échantillons d’ooplastes réduits aux mitochondries ont des valeurs de tomodensitométrie plus élevées que les échantillons des deux autres groupes.Pour une bisection infructueuse, la bisection ne réduit pas efficacement la teneur en ADNmt dans les ooplastes réduits par les mitochondries. Suite à la production d’une courbe standard et à l’utilisation des formules de nombre de copies d’ADNmt fournies, une réduction moyenne de l’ADNmt ovocyte de 93,88% a été obtenue à l’aide de ce protocole. Orienter correctement chaque ovocyte dans la goutte de bisection, couper précisément chaque ovocyte en deux et trier avec précision les ooplastes sont toutes des étapes critiques à suivre pour obtenir des résultats positifs.Deux ooplastes peuvent être fusionnés avec une cellule somatique. Les triplés fusionnés peuvent ensuite être activés chimiquement et cultivés en tant qu’embryons reconstruits.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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