1.9K Views
•
11:41 min
•
June 16th, 2022
DOI :
June 16th, 2022
•0:05
Introduction
0:53
Mounting Fish for Confocal Scanning
3:05
Confocal Scanning
5:41
Optional Method: Remove and Re-Introduce Muscle Electrical Activity
9:01
Results: Accurate and Efficient Estimation of the Muscle Volume of Live Zebrafish Larvae at Selected Stages of Activity
11:01
Conclusion
Transcript
Vores protokol giver os mulighed for at studere, hvordan væv, såsom skeletmuskulatur, regulerer deres størrelse, hvilket fortsat er et centralt spørgsmål i celle- og udviklingsbiologi med vigtige fysiologiske og medicinske konsekvenser. Den største fordel ved vores teknik er, at cellulær vækst kan observeres og måles i levende dyr in vivo med en høj grad af rumlig og tidsmæssig nøjagtighed. Fremskridt i den grundlæggende forståelse af tidlig muskelvækst kan fremhæve den udviklingsmæssige oprindelse af tidlige muskelproblemer og føre til opdagelsen af Novo Therapeutics for at beskytte mod muskeltab hos ældre og patienter med muskelsvindsforstyrrelser.
Forbered 1% LMA i et 1,5 milliliter rør og opbevar det i en 37 grader Celsius varmeblok til gentagen brug. Vælg fisk, der skal monteres, og bedøm hver fisk forbigående. For at undgå varmechok skal du fjerne LMA-aliquoten fra varmeblokken og lade den køle af til lige over indstillingen.
Tag en 60 ml petriskål, der er belagt med et lag på 1% LMA, og læg den på scenen i et dissekerende mikroskop. Overfør larven med en en milliliter plastik Pasteur-pipette på en 60 millimeter belagt petriskål og fjern så meget overført medium som muligt. Derefter, stadig ved hjælp af Pasteur-pipetten, skal du placere et par dråber LMA på fisken og hurtigt orientere larven nær LMA's øvre overflade med sin anteroposterior og dorsoventrale akse inden for 10 grader fra vandret ved hjælp af tang eller en ildpoleret, fin glasnål, før LMA sætter sig.
Alternativt kan du bruge en Pasteur-pipette af plast. Saml larverne med minimum fiskemedium og overfør larverne til aliquot af afkølet LMA. Lad larven synke i fem sekunder for at blive helt omgivet af LMA.
Hent derefter larven og overfør den i en dråbe LMA på den agarosebelagte petriskål. Placer larven hurtigt som vist tidligere. Hvis larverne ikke er korrekt monteret vandret nær overfladen af agarosedråben, skal du fjerne og genindlejre, larver let hentes ved blid sugning ved hjælp af en en milliliter plastik Pasteur-pipette, og LMA kan forsigtigt fjernes ved hjælp af chem-servietter.
Vent i ca. 10 minutter, indtil LMA sætter sig. Oversvøm skålen med omkring 10 ml tricainholdigt fiskemedium. For at fange konfokale stakke skal du lade den monterede fisk hvile i mindst 10 minutter før scanning, da agarose hævelse opstår.
Læg prøveskålen til stadiet af det konfokale system. Find larverne og fokuser på den ønskede somit. Somite 17 kan vælges på grund af dets lette lokalisering nær analventilen og lette billeddannelse.
Tjek ved at tælle somitter fra det forreste. For at tage YZ-billeder skal du konfigurere som for at fange en Z-stak. Start med at definere fiskens øverste og nederste punkter.
Både venstre og højre side kan fanges efter ønske, hvilket sikrer, at alle de hurtige YZ-scanninger fanger de ønskede regioner. Orienter scanningsområdet for fisken, som den konfokale software tillader. Placer fisken med anteroposterioraksen, parallelt med billedet dex-aksen og den dorsoventrale akse parallelt med Y-aksen med somit 17 i midten af feltet.
Fokuser på et mellemniveau plan i det øverste myotom, hvor hele epaxial og hypaxial somite halvdele sammen med den lodrette og vandrette myosepta er synlige og fange et XY-billede i høj opløsning. Navngiv filen, og gem billedet. For at fange YZ-billederne skal du tegne en præcis dorsal til ventral linje over den valgte somit, vinkelret på fiskens anteroposteriorakse.
Tilføj en valgt anteroposterior position, og udfør derefter en Z-staklinjescanning. Gentag YZ-linjescanningen tre gange på definerede anteroposteriorpositioner langs det valgte myotom for at fange YZA, YZM og YZP. Navngiv og gem disse billeder med det relaterede XY-billede.
Denne protokol er blevet betegnet som four slice-metoden, og billederne kan analyseres ved hjælp af Zen-software eller ImageJ. For at skabe et stimuleringskammer skal du tage en seks gange 35 millimeter brøndplade og skabe to små åbninger mindre end fem millimeter i diameter, en centimeter fra hinanden på hver side af hver brønd ved hjælp af et smalt loddejern. Når stimuleringskammeret er oprettet, kan det genbruges.
Tråd et par sølv- eller platintråde gennem åbningerne i hver brønd. Det genanvendelige klæbemateriale kan påføres nær åbningerne for at holde ledningerne på plads og sikre en afstand på en centimeter mellem ledningerne. Ved tre dage efter befrugtning opdeles fisk i tre forhold, fisk medium kontrol, inaktiv og inaktiv plus stamme.
For inaktive og inaktive plus stammegrupper bedøves larver 72 timer efter befrugtning med 0,6 millimolar tricain. For fiskens medium kontrolfisk, lad dem være ubedøvede. Forbered 60 ml 2% agarose i fiskemedium.
Smelt det grundigt ved hjælp af en mikrobølgeovn og lad det køle af. Tilsæt derefter tricain og hæld mindst fire milliliter i hver brønd i stimuleringskammeret. Tilføj straks specialfremstillede kamme med fire brønde mellem elektroderne.
Lad 10 minutter for gelen at sætte sig. Fjern kamme omhyggeligt for at skabe fire rektangulære brønde. Fyld hver brønd med tricainvand og læg en enkelt bedøvet, inaktiv plus stængellarve i hver brønd ved hjælp af en mikropipette med deres anteroposterior adgang vinkelret på elektroderne.
Kontroller under dissekering fluorescerende mikroskop, om hver fisk er fuldt bedøvet i hvert kammerbrønd. Tilslut en justerbar elektrofysiologisk, mønstergenererende stimulator til kammeret gennem en polaritetsregulator ved hjælp af krokodilleklip, der er forbundet til hver elektrode på den ene side af kammeret. Derefter stimuleres fisken som beskrevet i tekstmanuskriptet.
Kontroller regelmæssigt under mikroskopet for at bekræfte, at fisken stimuleres. Den elektriske stimulus skal fremkalde en synlig bilateral sammentrækning og let bevægelse en gang hvert femte sekund efter de beskrevne parametre. Efter stimulering fjernes fisk forsigtigt fra hver brønd ved forsigtigt at skylle dem ud med en plastpipette og vende tilbage til inkubatoren i et frisk, tricainholdigt fiskemedium.
Hæld tricainvandet væk inde fra kammeret og brug tang til at skære rundt og fjerne agarosen fra hver brønd, skyl brøndene med ledningsvand og lad dem tørre. Til analyse af muskelstørrelse, kaldet four slice-metoden, blev XY- og YZ-billeder af zebrafisklarvemuskel opnået, og somitvolumen blev beregnet. Der blev observeret en stærk sammenhæng mellem de fire skive- og full stack-metoder, selvom four slice-metoden gav et lidt større volumenestimat.
Volumetrisk analyse af de tilstødende myotomer af somitter 16 og 18 afslørede, at hver somit var ca. 7% større end den bagvedliggende. Yderligere undersøgelse afslørede, at en to-skive-metode, der kun kræver en enkelt YZ-måling, gav et rimeligt nøjagtigt skøn over myotomvolumen. Mynotomet voksede påviseligt i længden og tværsnitsarealet mellem to og fem dage efter befrugtning, hvilket førte til en stabil stigning i volumen.
Muskler gjort inaktive ved bedøvelse tricain mellem tredje og fjerde dag efter befrugtning havde signifikant reduceret volumen, hvilket indikerer, at larvemuskelvækst var aktivitetsafhængig. Større variation i reduktionen af myotomstørrelse blev observeret ved måling af myotomvolumen fire dage efter befrugtning sammenlignet med måling af hver enkelt fisk tre og fire dage efter befrugtning. Ikke desto mindre blev der ikke observeret nogen signifikant forskel i myotomvolumen mellem nogen af metoderne til myotommålinger.
Måling af antallet af fibre i myotomet såvel som det gennemsnitlige fibervolumen afslørede, at aktivitet styrer begge cellulære aspekter af vækst. Sørg for, at larverne bedøves fuldstændigt ved hjælp af frisklavet tricain. Delvis anæstesi ville føre til variabelt resultat.
Som vi ved, reagerer larver kraftigere på elektrisk stimulering. Denne metode, kombineret med downstream transkriptomics og farmakologiske eksperimenter, har afsløret ny indsigt i, hvordan kraftføling driver vækst i skeletmuskulaturen.
Optisk klarhed er en stor fordel for cellebiologisk og fysiologisk arbejde i zebrafisk. Der beskrives robuste metoder til måling af cellevækst hos enkelte dyr, der giver ny indsigt i, hvordan vækst af skeletmuskulatur og nabovæv integreres med hele kroppens vækst.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved