2.6K Views
•
10:56 min
•
August 1st, 2022
DOI :
August 1st, 2022
•0:05
Introduction
0:57
Perfusion Bioreactor Fabrication
1:29
Procurement of Porcine Flaps
5:51
Setup of the Decellularization System
7:39
Decellularization of Porcine Flaps and Evaluation of Decellularization
9:06
Results: Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps
10:16
Conclusion
Transcript
Denna metod beskriver den kirurgiska upphandlingen av tre vaskulariserade svinflikar och deras efterföljande perfusionsdecellularisering. Denna metod kan hjälpa till att regenerera svinflikar med hjälp av en vävnadsdecellularisering och recellulariseringsmetod. Den största fördelen med denna teknik är dess mångsidighet för att uppnå överflödsdecellularisering över en mängd olika vaskulariserade svinflikar i en enkel att montera bioreaktorinstallation.
Tekniken som beskrivs här kan i stor utsträckning tillämpas på andra vaskulariserade flikar som en potentiell vävnadsteknisk lösning med svinflikar vid rekonstruktiv kirurgi. För att börja, gör en inflödes- och utflödesslang genom att mäta cirka 50 centimeter LS16 platinabelagda silikonrör. Anslut ena änden till en gul 3-stopps pumpslang och den andra till en steril 2 ml serologisk pipett för att bära perfusat från tvättmedelsbehållarna till bioreaktorkammaren.
Autoklavera kammaren och slangarna i individuellt förpackade sterila förpackningar. För omental flikupphandling, placera en 12 veckor gammal bedövad Yorkshire-gris i ryggläge och förbered sedan buken på vanligt sterilt sätt. Utför en xipho-navel laparotomi för att komma in i buken och mobilisera magen cephalad och placera omentum i det operativa fältet.
Från och med den vänstra aspekten av den större krökningen, där den vänstra gastroepiploiska artären förenar mjältartären, skelettiserar den vänstra gastroepiploiska artären och venen med rak Stevens tenotomy sax. Ligera sedan och dela båda separat med kirurgiska band eller klämmor. Fortsätt längs den större krökningen i magen från vänster till höger för att ligera och dela de korta vaskulära grenarna som härrör från omentumet, vilket ger den större krökningen i magen.
Fortsätt mobiliseringen av det större omentumet tills korsningen av de högra gastroepiploiska kärlen och gastroduodenalartären påträffas. Ligera sedan och dela upp den högra gastroepiploiska artären och venen för att frigöra den omentala klaffen och möjliggöra klaffkannulering senare. För tensor fascia lata flikupphandling, placera grisen i lateral decubitusposition.
Markera den inre klaffgränsen från den främre överlägsna iliac ryggraden, eller ASIS, mot lateral patella och en bakre gräns cirka 8 till 10 centimeter kaudalt. Använd en skalpell för att göra ett skarpt snitt vid den distala marginalen vid patella. Fördjupa snittet genom de subkutana vävnaderna för att nå fascian över rectus femoris och fortsätt snitten mot ASIS längs de markerade gränserna.
För att isolera den fasciala klaffen ensam, ta bort den överliggande hudkomponenten från det underliggande fasciaskiktet. Sedan ligat eller cauterize små perforatorkärl till huden. Återgå till klaffens distala kant och snitta den djupa fascian.
Mobilisera fascian från den underliggande vastus lateralis-muskeln mot ASIS. Efter att ha spårat pedikeln mot de djupa lårbenskärlen, skelettisera den laterala circumflex lårbensartären och venen som levererar fascialklaffen. Ligera sedan och dela klaffkärlen proximalt, där de förenar de djupa lårbenskärlen och möjliggör senare kanalisering.
För radiell underarmsflikupphandling, markera en kvadrat på 3 x 3 centimeter på den radiella aspekten av en förlängd grisunderarm. Rita en linje mellan mittpunkten för den proximala klaffmarginalen och den antecubitala fossan för att beteckna den ungefärliga kursen för den radiella artärpedikeln. Bekräfta artärkursen med palpation.
Skär sedan huden med en skalpell vid den distala aspekten med ett djup upp till antebrachial fascia. Trubbig dissekera med tenotomy sax tills den distala radiella artären och dess vena comitantes påträffas. Ligera sedan och dela artären och venerna med kirurgiska band eller klämmor.
Fortsätt hudens snitt på de radiella och ulnara marginalerna på den markerade hudrutan. Mobilisera sedan klaffen från det underliggande radiella benet med ett kirurgiskt blad eller cautery, som fortsätter från en ulnar till radiell riktning medan du höjer hudfliken proximalt mot antecubital fossa. Med hjälp av tenotomy sax skelettiserar den radiella artären och vena comitantes proximalt vid antecubital fossa, där de går med i brachialartären respektive venerna.
Dissekera kärlen från de omgivande fibrofettvävnaderna för att isolera kärlpedikeln. Ligera sedan och dela artären och venen separat för att frigöra den radiella underarmsfliken. Därefter kannulera pedikelkärlen med 20 till 24-gauge angiokateter säkrad med 3-0 silkesband.
Spola hepariniserad saltlösning i klaffens arteriella kanyl tills ett tydligt venöst utflöde observeras. När du arbetar i ett laminärt flöde Biosäkerhetsskåp, placera klaffar i bioreaktorns vävnadskammare. Prima inflödesslangar med steril hepariniserad saltlösning för att avlägsna kvarvarande luft och ordna klaffar för att möjliggöra anslutning mellan klaffartärkanylen och den manliga luerkontakten.
Använd sedan sterila hemostater för att skruva artärkanylen på kontakten. Spola sedan den hepariniserade saltlösningen genom stoppkranen för att kontrollera att lueranslutningen är utan läckage och att flopparna kan genomsyras med bevis på venöst utflöde. Efter stängning av vävnadskammarens lock, anslut inflödesslangen med en gul 3-stopps pumpslang till vävnadskammarens inflödesstoppkran.
Fäst också en inbyggd tryckgivare till inflödets 3-vägs stoppkran för övervakning av perfusionstryck. Slå sedan på inflödet peristaltisk pump och på startskärmen, gå till den tredje fliken med pilen för att ställa in slang-ID till 1,85 millimeter. Ställ sedan in perfusionshastigheten från den andra fliken.
Ingångshastigheten som leveranssätt är inställd på 2 milliliter per minut. Se till att flödesriktningen är korrekt som visas på skärmen. Ladda 3-stoppspumpslangen till den peristaltiska pumpen med en kompatibel kassett.
Ställ in utflödespumpens inställning på en hastighet på 4 ml per minut. Anslut utflödesslangen med en gul 3-stopps pumpslang till vävnadskammarens utflödesstoppkran. Ladda sedan 3-stegs pumpslangen till den peristaltiska pumpen och starta flödet för båda pumparna genom att trycka på strömbrytaren på varje pump.
Börja perfusionsdecellulariseringen av flikar med hepariniserad saltlösning i vävnadskammaren i 15 minuter för att avlägsna eventuella kvarhållna blodproppar. När du är klar, byt ut den återstående saltlösningen med 500 ml natriumdodecylsulfat, eller SDS, decellulariseringslösning för att sänka ner klaffen. Överför sedan inflödesslangen till SDS-lösningen och riklig vävnaden.
Efter SDS-decellularisering, aspirera de återstående SDS innan du perfuserar klaffen med PBS i en dag. Efter SDS-perfusionsdecellularisering, perfusera sekventiellt flikarna i DNA-lösning i två timmar och sedan i PBS i en dag, följt av överföring av inflödesslangen till perättiksyra och etanol i destillerat vatten för att sterilisera flikarna genom att perfusera i tre timmar. När du är klar, ta bort flikarna aseptiskt och sänk ner dem i två tvättar av PBS som innehåller 1% antibiotika antimykotika i 15 minuter vardera.
Förvara klaffar vid 4 grader Celsius tills de är klara för recellularisering. Använd ett 3 till 10 millimeter stansbiopsiverktyg för att få vävnadsprover för utvärdering av decellulariserade flikar. De isolerade decellulariserade flikarna som spolades under manuell kontroll visade tecken på utflöde från den fritt dränerande venösa kanylen av omentum, tensor fascia lata och radiell underarmsflik.
Den grova morfologin hos den inhemska omentum, tensor fascia lata och radiella underarmsflikar verkade rosa färgade omedelbart efter upphandlingen. I jämförelse var decellulariserade vävnader karakteristiskt vita eller ogenomskinliga i utseende. Histologisk undersökning av inhemska vävnader med hematoxylin och eosin visade närvaron av blå kärnor.
I decellulariserade flikar avslöjade histologisk färgning förlust av cellulärt material utan blå kärnfärgning, vilket indikerar en acellulär vävnadsställning. Ytterligare kvantifiering av DNA-innehåll visade en signifikant minskning av DNA i acellulära byggnadsställningar jämfört med inhemska vävnader. Det viktigaste övervägandet är en kirurgisk teknik som används vid upphandling, var noga med att undvika skador på klaffpedikeln för att möjliggöra efterföljande perfusionsdecellularisering.
Efter perfusionsdecellularisering kan de resulterande flikarna recellulariseras med vävnadsspecifika cellpopulationer för att regenerera de ursprungliga vävnadsfacken.
Protokollet beskriver den kirurgiska tillvaratagandet och efterföljande decellularisering av vaskulariserade svinflikar genom perfusion av natriumdodecylsulfattvättmedel genom klaffvaskulaturen i en anpassad perfusionsbioreaktor.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved