Name: embryo rescue protocol for interspecific hybridization in squash
Uploaded: 2022-09-12T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA, NRS Project No. FLA-TRC-006176 et l’Institut des sciences alimentaires et agricoles de l’Université de Floride.

1. Plantation et pollinisation
REMARQUE : Il est important d’identifier les génotypes compatibles dont l’hybridation aboutirait à la nouaison et à la production d’embryons viables.
<ol><li>Conditions de plantation et entretien<ol><li>Obtenir des semences de génotypes de courges (cultivars/accessions) pour l’hybridation (tableau 1).</li>
		<li>Remplir 50 cellules plates de départ (25 cm de largeur x 50 cm de longueur) avec du terreau amendé avec...

<ol>
	<li>Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Resources+of+Pumpkins+and+Squash,+Cucurbita+spp.">Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp.</a> Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).</li><li>Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellites+for+the+genus+Cucurbita+and+an+SSR-based+genetic+linkage+map+of+Cucurbita+pepo+L.">Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L.</a> Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).</li><li>Paris, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+genetic+relationships+in+Cucurbita+pepo+(Cucurbitaceae)+using+DNA+markers.">Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers.</a> Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).</li><li>Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cucurbits. , (1997).</li><li>Teppner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cucurbita+pepo+(Cucurbitaceae)-history,+seed+coat+types,+thin+coated+seeds+and+their+genetics.">Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics.</a> Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).</li><li>Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+pumpkin+(Cucurbita+moschata+Duch.+Ex+Poir.)+for+fruit+yield+and+other+characters.">Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters.</a> International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).</li><li>Paris, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+the+cultivar-groups+of+Cucurbita+pepo.">History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo.</a> Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).</li><li>Baggett, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attempts+to+cross+Cucurbita+moschata+(Duch.)+Poir.+'Butternut+and+C.+pepo+L.+'Delicata'.">Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'.</a> The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).</li><li>Erwin, A. T., Haber, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+Varietal+Crosses+in+Cucurbits.">Species and Varietal Crosses in Cucurbits.</a> Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).</li><li>Whitaker, T. W., Bohn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taxonomy,+genetics,+production+and+uses+of+the+cultivated+species+of+Cucurbita.">The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita.</a> Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).</li><li>Bemis, W. P., Nelson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+hybridization+within+the+genus+Cucurbita+I,+fruit+set,+seed+and+embryo+development.">Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development.</a> Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).</li><li>Washek, R. L., Munger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+of+Cucurbita+pepo+with+disease+resistant+Cucurbita+species.">Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species.</a> The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).</li><li>Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+heterosis+in+Cucurbita+moschata+and+Cucurbita+pepo+interspecific+hybrids.">Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids.</a> International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).</li><li>De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+papaya+ringspot+virus+in+summer+squash+Cucurbita+pepo+L.+introgressed+from+an+interspecific+C.+pepo&#215;+C.+moschata+cross.">Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo&#215; C. moschata cross.</a> Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).</li><li>Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Cucurbita+interspecific+hybrids+through+cross+pollination+and+embryo+rescue+technique.">Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique.</a> World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).</li><li>Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+advanced+interspecific-bridge+lines+among+Cucurbita+pepo,+C.+maxima,+and+C.+moschata.">Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata.</a> HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).</li><li>Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+four+cucurbit+viruses+in+Cucurbita+moschata.">Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata.</a> Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).</li><li>Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+marker-assisted+pyramiding+of+genes+for+resistance+to+zucchini+yellow+mosaic+virus+in+oilseed+pumpkin+(Cucurbita+pepo).">Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo).</a> Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).</li><li>Hayase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cucurbita-crosses.+XV.+Flower+pollination+at+4+am+in+the+production+of+C.+pepo+x+C.+moschata+F1+hybrids.">Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids.</a> Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).</li><li>Reed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+rescue.">Embryo rescue.</a> Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).</li><li>Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+rescue+in+plants-a+review.">Embryo rescue in plants-a review.</a> Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).</li><li>Wall, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+hybrids+of+Cucurbita+obtained+by+embryo+culture.">Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture.</a> Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).</li><li>Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+cross+between+Cucurbita+pepo+L.+and+Cucurbita+martinezii+through+in+vitro+embryo+culture.">Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture.</a> Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).</li><li>Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+size+analysis+in+the+genus+Cucurbita+and+its+use+for+determination+of+interspecific+hybrids+obtained+using+the+embryo-rescue+technique.">Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique.</a> Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).</li><li>Giancaspro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+in+vitro+embryo+rescue+protocol+for+breeding+seedless+table+grapes+(Vitis+vinifera+L.)+in+Italy.">Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy.</a> Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).</li><li>Warchol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+genotype,+media+composition,+pH+and+sugar+concentrations+on+oat+(Avena+sativa+L.)+doubled+haploid+production+through+oat+x+maize+crosses.">The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).</li><li>Nepi, M., Pacini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollination,+pollen+viability+and+pistil+receptivity+in+Cucurbita+pepo.">Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo.</a> Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).</li><li>Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+sensory+changes+during+development+and+storage+of+buttercup+squash.">Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash.</a> New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).</li><li>Moon, P., Meru, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+rescue+of+aged+Cucurbita+pepo+seeds+using+squash+rescue+medium.">Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium.</a> Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).</li><li>Nu&#241;ez-Palenius, H. G., Ram&#237;rez-Malag&#243;n, R., Ochoa-Alejo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muskmelon+embryo+rescue+techniques+using+in+vitro+embryo+culture.">Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture.</a> Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).</li><li>Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+development+and+seed+fill+in+hull-less+seeded+cultigens+of+pumpkin+(Cucurbita+pepo+L).">Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L).</a> Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).</li><li>Vining, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).</li></ol>

Il existe deux principaux goulots d’étranglement pour une hybridation interspécifique réussie entre C. moschata et C. pepo : la barrière de compatibilité croisée, qui est déterminée par la réactivité du génotype pour produire des embryons hybrides, et les barrières post-fécondation, qui entravent le développement d’embryons hybrides vers des graines normales. Comme indiqué précédemment pour les courges, le test de compatibilité croisée de la présente étude a révélé que la plu...

Cucurbita (2n = 40) est un genre très diversifié de la famille des Cucurbitaceae qui contient 27 espèces différentes, dont cinq sont domestiquées1. Parmi ceux-ci, Cucurbita moschata, C. pepo et C. maxima sont les plus importants économiquement au monde. Aux États-Unis, C. moschata et C. pepo sont les deux espèces les plus importantes dans la production agricole. C. pepo se compose de quatre sous-espèces (ovifera, pepo, fraternel et gumala) qui contiennent des groupes de cultivars de courges d’été et d’hiver : crookneck, straightneck, gland, pétoncle, cocozelle, moelle végétale, courgette et citrouille 2,3,4,5. C. moschata se compose principalement de types de marchés de courges d’hiver, y compris le noyer cendré, le Dickinson et le groupe de fromages1. Les deux espèces sont morphologiquement et phénotypiquement diverses, avec C. pepo considéré pour son rendement, sa précocité, son habitude de croissance dans les buissons et divers traits de fruits, y compris la forme du fruit, la taille du fruit, la couleur de la chair et le motif de l’écorce. D’autre part, C. moschata est prisé pour son adaptation à la chaleur et à l’humidité, ainsi que pour sa résistance aux maladies et aux ravageurs 6,7. L’hybridation interspécifique entre C. moschata et C. pepo est non seulement une stratégie importante pour l’introgression des caractéristiques souhaitables entre les deux espèces, mais permet également l’élargissement de la base génétique dans les programmes de sélection 7,8.
Les premiers croisements entre C. moschata et C. pepo ont été effectués pour déterminer leur compatibilité et/ou leurs barrières taxonomiques 9,10,11, tandis que les études ultérieures se sont principalement concentrées sur le transfert des caractères souhaitables12,13,14. L’hybridation interspécifique entre les deux espèces a ciblé le transfert de caractères nouveaux tels qu’un mode de croissance buisson ou semi-arbuste et un rendement amélioré de C. pepo ainsi qu’une résistance aux maladies, une adaptabilité au stress abiotique et une vigueur accrue de C. moschata14,15,16. Par exemple, des croisements spécifiques entre C. pepo (P5) et C. moschata (MO3) ont entraîné un rendement en fruits plus élevé 13, tandis que les accessions de C. moschata (Nigerian Local et Menina) ont été largement utilisées comme principale source de résistance aux potyvirus dans les cultivars cultivés de C. pepo 17,18. 
Des études antérieures ont montré que l’hybridation entre C. moschata et C. pepo est possible mais difficile 8,15. Les croisements interspécifiques pourraient aboutir à l’absence de nouaison (avortement), à des fruits parthénocarpiques dépourvus de graines viables (graines vides), à des fruits sans pépins où les embryons immatures ne se développent pas (sténospermocarpie) ou à des fruits avec peu d’embryons immatures qui peuvent être sauvés en plantes matures par le sauvetage d’embryons15,16. Par exemple, aucune graine viable n’a été obtenue en croisant C. pepo (reine de table, maternelle) avec C. moschata (gros fromage, paternel), mais le croisement réciproque a donné 57 graines viables issues de 134 pollinisations9. Hayase n’a obtenu des graines viables à partir de croisements de C. moschata et de C. pepo que lorsque des croisements ont été effectués à 04h00 du matin en utilisant du pollen stocké à 10 ° C pendant la nuit19. Baggett a croisé huit variétés différentes de C. moschata avec C. pepo (delicata) et a rapporté que sur 103 pollinisations totales, 83 fruits semblaient normaux avaient été obtenus, mais aucun d’entre eux ne contenait de graines viables8. Dans un croisement entre C. pepo (S179) et C. moschata (NK), Zhang et al. ont obtenu 15 fruits avec 2 994 graines, mais seulement 12 de ces graines étaient viables tandis que les autres ne présentaient qu’un développement rudimentaire. Ces études suggèrent que même si le croisement interspécifique entre C. moschata et C. pepo est très bénéfique, l’obtention de fruits avec des graines viables à partir des croisements est exigeante16.
Le sauvetage d’embryons a été suggéré comme une méthode appropriée pour surmonter les problèmes découlant d’embryons avortés précocement ou mal développés et est l’une des techniques de culture in vitro les plus anciennes et les plus efficaces pour la régénération d’embryons immatures16,20. Le sauvetage embryonnaire implique la culture in vitro d’embryons sous-développés/immatures, suivie d’un transfert dans un milieu nutritif stérile pour faciliter la récupération des plantules et, finalement, des plantes matures21. Bien que le sauvetage d’embryons soit couramment utilisé dans l’élevage de courges, il n’existe pas de description détaillée de la méthodologie appropriée qui permettrait son application courante. L’utilisation d’une technique de sauvetage d’embryons pour surmonter les obstacles à l’hybridation interspécifique chez les espèces de Cucurbita a été signalée dès 195422. Cependant, le succès du sauvetage d’embryons dans les premières études n’a pas été rapporté ou était très faible. Metwally et al. ont rapporté un taux de réussite de 10% (régénération en plantes matures) parmi 100 embryons hybrides interspécifiques sauvés d’un croisement entre C. pepo et C. martinezii23. Sisko et al. ont rapporté un taux de réussite variable de la régénération embryonnaire parmi les embryons obtenus à partir de différentes combinaisons croisées : le taux de régénération des hybrides obtenus en croisant C. maxima (Bos. Max) et C. pepo (ruée vers l’or) était de 15,5 %, pour C. pepo (courgette) et C. moschata (Hokaido) était de 20 %, tandis que pour C. pepo (ruée vers l’or) et C. moschata (Dolga), il était de 37,5 %24. Outre le génotype, les milieux et les conditions de culture in vitro sont des facteurs importants pour le succès de la technique25,26. Dans la présente étude, diverses combinaisons croisées entre C. moschata et C. pepo ont été testées, et une méthodologie simple pour utiliser la technique de sauvetage d’embryons dans les courges a été développée. La mise au point d’une technique simple et facilement reproductible de sauvetage d’embryons facilitera l’hybridation interspécifique et l’amélioration du germoplasme dans les programmes de sélection des courges.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Steris</td>
			<td>AMSCO LAB 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefotaxime</td>
			<td>Sigma Alfrich</td>
			<td>C 7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Sigma Alfrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detergent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol, 95%</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gellan gum</td>
			<td>Caisson Laboratories</td>
			<td>G024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>growth chamber or illuminated shelf</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar hood / biosafety cabinet</td>
			<td>The Baker Company, Inc</td>
			<td>Edgegard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>masking tape</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-11735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>media bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M10200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPK fertilizer (20-20-20)</td>
			<td>BWI Companies, Inc</td>
			<td>&#160;PR200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote Plus fertilizer</td>
			<td>BWI Companie,s Inc</td>
			<td>OS90590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma Alfrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>USA Scientific, Inc</td>
			<td>8609-0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plant pots</td>
			<td>BWI Companies, Inc</td>
			<td>NP4000BXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic food containers, reused</td>
			<td>Oscar Mayer</td>
			<td>4470003330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic hang tags</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07QTZRY6T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potting mix</td>
			<td>Jolly Gardener</td>
			<td>Pro-Line C/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seedling starter trays</td>
			<td>BWI Companies Inc</td>
			<td>GPPF128S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter (0.22 um )</td>
			<td>ExtraGene</td>
			<td>B25CA022-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trellis support</td>
			<td>The Home Depot</td>
			<td>&#160;2A060006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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embryo rescue protocol for interspecific hybridization in squash

L’hybridation interspécifique dans les cultures de Cucurbita (courge) est souhaitable pour élargir la variation génétique et pour l’introgression des allèles utiles. Les embryons immatures issus de ces larges croisements doivent être régénérés à l’aide de techniques appropriées de sauvetage d’embryons. Bien que cette technique soit bien établie pour de nombreuses cultures, il n’existe pas de description détaillée de la méthodologie appropriée pour les courges qui permettrait son application courante. Ici, nous décrivons un protocole de sauvetage d’embryons utile pour l’hybridation interspécifique de C. pepo et C. moschata. Pour identifier des combinaisons viables pour le sauvetage d’embryons, 24 croisements interspécifiques ont été effectués. La nouaison a été obtenue à partir de vingt-deux croisements, ce qui indique un taux de réussite de 92%. Cependant, la plupart des fruits obtenus étaient parthénocarpiques, avec des graines dépourvues d’embryons (graines vides). Une seule combinaison croisée contenait des embryons immatures qui pouvaient être régénérés à l’aide de milieux de croissance de plantes basaux. Au total, 10 embryons ont été sauvés du fruit interspécifique F1 , et le taux de réussite du sauvetage embryonnaire était de 80%. Le protocole de sauvetage des embryons développé ici sera utile pour l’hybridation interspécifique dans les programmes de sélection de courges.

Viabilité de la nouaison et des graines Un essai initial a été effectué pour déterminer la viabilité de la nouaison et des graines dans diverses combinaisons croisées. Au total, 15 génotypes de courges, quatre C. pepo et 11 C. moschata, ont été choisis (tableau 1). Sur les 24 combinaisons croisées interspécifiques tentées, une nouaison a été obtenue pour 22 (tableau 2), ce qui représente un succès global de >92 % dans la nouaison. Au...

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Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash

L’article décrit un protocole de sauvetage d’embryons pour la régénération d’embryons immatures issus de l’hybridation interspécifique de Cucurbita pepo et Cucurbita moschata. Le protocole peut être facilement reproduit et constituera une ressource importante pour les programmes de sélection de courges.

Protocole de sauvetage d’embryons pour l’hybridation interspécifique en courge

Interspecific hybridization in Cucurbita crops (squash) is desirable for widening genetic variation and for the introgression of useful alleles. Immature ...

Le protocole de sauvetage des embryons est obligatoire pour la régénération des embryons immatures issus de croisements interspécifiques entre différentes espèces de Cucurbita. Il est le plus souvent utilisé pour les croisements entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité.Le protocole utilise uniquement des milieux de SEP avec des antibiotiques. Par conséquent, il peut être facilement reproduit par n’importe quel laboratoire. Il serait possible de modifier cette technique pour étudier différents obstacles à l’hybridation interspécifique ou intergénérique.Prêter attention aux détails à chaque étape sera utile pour un résultat réussi. Commencez par planter les plantes Cucurbita en remplissant 50 cellules de départ de 25 par 50 centimètres en utilisant un terreau complété par de l’engrais complet à base d’azote, de phosphore et de potassium, contenant 1,38 gramme par kilogramme d’azote, de phosphore et de potassium chacun. Ensuite, semez les graines à une profondeur égale à leur longueur et recouvrez-les avec le terreau.Arrosez les appartements sans créer d’eau stagnante et gardez le média humide en les arrosant une fois par jour. À la fin du deuxième stade foliaire vrai, transplantez les plants dans des pots de 30 centimètres de diamètre complétés par trois cuillères à soupe d’engrais complet par pot. Après tous les sept jours, fertilisez chaque pot avec 500 millilitres d’engrais liquide contenant 20, 20, 20 azote, phosphore et potassium dans un gramme ajouté à un gallon d’eau.Maintenez les plantes dans la serre à des températures comprises entre 22 et 28 degrés Celsius sous le régime de la lumière naturelle. Pour les génotypes de vining, prévoir un treillis de soutien dans la serre. Effectuer l’hybridation ou la pollinisation contrôlée dès que les plantes commencent à fleurir six à huit semaines après le semis.Vérifiez les fleurs non ouvertes ayant une teinte jaune sur les pétales et identifiez les fleurs mâles et les fleurs femelles des cultivars Cucurbita pepo et Cucurbita moschata. Pour éviter la pollinisation accidentelle par les insectes, collez doucement la fleur fermée au sommet à l’aide de ruban de masquage. Le lendemain matin, effectuez la pollinisation avant 10h00 en retirant doucement la partie supérieure collée de la fleur mâle et femelle.Séparer les pétales de la fleur mâle et transférer les pollens en frottant doucement l’anthère sur le stigmate de la fleur femelle. Après la pollinisation, fermez immédiatement la fleur femelle pollinisée avec du ruban de masquage et utilisez une étiquette pour enregistrer la date de pollinisation et indiquer les parents paternels et maternels utilisés dans le croisement. Un croisement réussi indiqué par un ovaire élargi formera un petit fruit en une semaine.Récoltez les fruits après 45 à 55 jours de pollinisation. Préparez un stock de céfotaxime. Filtrez-le à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 micron.Et faites des aliquotes de 0,5 millilitre de 250 milligrammes par millilitre de céfotaxime avant de les stocker à moins 20 degrés Celsius. De même, préparez le stock d’ampicilline. Filtrez-le à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 micron et préparez des aliquotes d’un millilitre de 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline avant de les stocker à moins 20 degrés Celsius.Préparer Murashige et Skoog, ou milieu MS en dissolvant 2,45 grammes du milieu dans 500 millilitres d’eau distillée dans une bouteille d’un litre. Ajouter 1,5 gramme de gomme gellane au milieu MS et autoclaver à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Refroidissez le milieu en plaçant la bouteille dans un bain-marie à 50 degrés Celsius.Décongeler les stocks d’antibiotiques à l’intérieur de l’armoire à flux laminaire. Transférer le flacon moyen dans la hotte à flux laminaire et ajouter 0,6 millilitre de bouillon de céfotaxime et 0,25 millilitre de bouillon d’ampicilline au milieu avec un mélange approprié. Versez environ sept millilitres du milieu dans une boîte de Petri stérile de 60 par 15 millimètres.Laisser le milieu se solidifier dans les boîtes de Petri pendant environ 15 à 20 minutes. Fermez les boîtes de Petri avec une pellicule hertzicole et placez-les dans une boîte de rangement à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ultérieurement. Récoltez les fruits de la courge en les coupant de la vigne principale et désinfectez les fruits en lavant leur surface dans l’évier de laboratoire à l’aide d’un détergent liquide comme 0,3% de chloroxylénol.Rincez les fruits avec beaucoup d’eau du robinet et séchez-les avec des serviettes en papier propres avant de transférer les fruits dans l’armoire à flux d’air stratifié. Stérilisez la surface du fruit à l’intérieur de l’armoire en pulvérisant de l’éthanol à 70%. Couper le fruit en deux avec un couteau stérile et extraire les graines.Utilisez des pinces ou des mains stériles avec des gants stériles pour ouvrir de manière aseptique le tégument et exposer les embryons immatures avant de les placer dans une boîte de Petri contenant un milieu de SEP supplémenté en antibiotiques. Scellez les plaques de Petri à l’aide d’un film d’emballage et placez-les dans une chambre de croissance ayant une température de 25 degrés Celsius, une période de photo de 16 heures et une humidité relative de 70%. En cas de contamination, sous-cultiver immédiatement les embryons non contaminés dans une nouvelle plaque ayant le même milieu.Une fois que les racines sont développées après 10 à 14 jours, et que les cotylédons sont développés après 15 à 21 jours, retirez les plantules des boîtes de Petri et lavez doucement le milieu présent autour des racines avec de l’eau du robinet. Placez les plantules nettoyées dans un récipient en plastique de 14 centimètres sur 9 centimètres sur 4 et recouvrez les racines avec des serviettes en papier humides. Couvrez le contenant et réhumidifiez les serviettes en papier si nécessaire.Gardez les contenants en plastique à 25 à 28 degrés Celsius, et pendant une période de photo de 16 heures pour acclimater les plantules tout en maintenant l’état humide des serviettes en papier. Après 7 à 10 jours d’acclimatation, transférer les semis de trois à quatre centimètres de long dans des appartements de 50 cellules contenant un terreau commercial amendé avec de l’engrais et les déplacer vers la serre. Évitez de trop arroser pour éviter la pourriture et ajoutez environ 10 à 20 millilitres d’eau par cellule au besoin.Au deuxième au troisième stade foliaire vrai, transplantez les plantules dans des pots de 25 centimètres de diamètre remplis de terreau modifié avec de l’engrais et effectuez une hybridation contrôlée lorsque les plantes commencent à fleurir. Maintenez les plantes dans la serre à 22 à 28 degrés Celsius sous le régime de la lumière naturelle. Et évaluer les caractéristiques des plantes pour les fruits et les graines.Quatre Cucurbita pepo et 11 Cucurbita moschata ont été choisis pour l’hybridation interspécifique. Sur 24 combinaisons croisées interspécifiques tentées, une nouaison a été obtenue pour 22 croisements représentant plus de 92% de succès dans la nouaison. Les croisements entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo impliquant les génotypes O et M, et les génotypes E et J, n’ont produit aucun fruit mûr.Alors que le croisement entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo impliquant les génotypes F et J, a produit six fruits. Le nombre de fleurs pollinisées pour différentes combinaisons croisées variait de 1 à 11. Et le taux de réussite de la pollinisation variait de 0% à 100%Sur 44 fruits produits à partir de toutes les combinaisons croisées, un seul fruit d’un croisement entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo, les génotypes C et J ont produit des embryons immatures qui ont pu être sauvés.Pour le développement de ces embryons peu développés, ils ont été cultivés à l’aide des milieux de sauvetage d’embryons, ce qui a entraîné un taux de réussite de 80% pour le sauvetage d’embryons. Les deux procédures les plus importantes sont l’identification des croisements compatibles entre deux espèces, à savoir Cucurbita moschata et Cucurbita pepo, et la régénération réussie des embryons. Étant donné que la technique de sauvetage d’embryons est simple et facilement reproductible, les éleveurs de courges du monde entier peuvent utiliser cette technique pour sauver des embryons immatures issus de croisements interspécifiques entre différentes espèces de Cucurbita.

Research

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Biology

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Non radioactifs In situ</emProtocole d&#39;hybridation> Applicable pour l&#39;épinette de Norvège et d&#39;un éventail d&#39;espèces végétales

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

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Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...