Name: embryo rescue protocol for interspecific hybridization in squash
Uploaded: 2022-09-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למזון וחקלאות של USDA, פרויקט NRS מס '. FLA-TRC-006176 והמכון למדעי המזון והחקלאות של אוניברסיטת פלורידה.

1. שתילה והאבקה
הערה: חשוב לזהות גנוטיפים תואמים שההכלאה שלהם תביא לסט פירות ולייצור עוברים בני קיימא.
<ol><li>תנאי שתילה ותחזוקה<ol><li>השג זרעים של גנוטיפים של דלעת (cultivars/accessions) להכלאה (טבלה 1).</li>
		<li>מלאו 50 תאים התחלתיים (25 ס"מ רוחב x 50 ס"מ אורך) עם חומר עציץ מתוקן ...

<ol>
	<li>Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Resources+of+Pumpkins+and+Squash,+Cucurbita+spp.">Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp.</a> Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).</li><li>Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellites+for+the+genus+Cucurbita+and+an+SSR-based+genetic+linkage+map+of+Cucurbita+pepo+L.">Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L.</a> Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).</li><li>Paris, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+genetic+relationships+in+Cucurbita+pepo+(Cucurbitaceae)+using+DNA+markers.">Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers.</a> Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).</li><li>Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cucurbits. , (1997).</li><li>Teppner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cucurbita+pepo+(Cucurbitaceae)-history,+seed+coat+types,+thin+coated+seeds+and+their+genetics.">Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics.</a> Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).</li><li>Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+pumpkin+(Cucurbita+moschata+Duch.+Ex+Poir.)+for+fruit+yield+and+other+characters.">Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters.</a> International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).</li><li>Paris, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+the+cultivar-groups+of+Cucurbita+pepo.">History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo.</a> Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).</li><li>Baggett, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attempts+to+cross+Cucurbita+moschata+(Duch.)+Poir.+'Butternut+and+C.+pepo+L.+'Delicata'.">Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'.</a> The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).</li><li>Erwin, A. T., Haber, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+Varietal+Crosses+in+Cucurbits.">Species and Varietal Crosses in Cucurbits.</a> Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).</li><li>Whitaker, T. W., Bohn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+taxonomy,+genetics,+production+and+uses+of+the+cultivated+species+of+Cucurbita.">The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita.</a> Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).</li><li>Bemis, W. P., Nelson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+hybridization+within+the+genus+Cucurbita+I,+fruit+set,+seed+and+embryo+development.">Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development.</a> Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).</li><li>Washek, R. L., Munger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+of+Cucurbita+pepo+with+disease+resistant+Cucurbita+species.">Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species.</a> The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).</li><li>Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+heterosis+in+Cucurbita+moschata+and+Cucurbita+pepo+interspecific+hybrids.">Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids.</a> International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).</li><li>De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+papaya+ringspot+virus+in+summer+squash+Cucurbita+pepo+L.+introgressed+from+an+interspecific+C.+pepo&#215;+C.+moschata+cross.">Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo&#215; C. moschata cross.</a> Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).</li><li>Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Cucurbita+interspecific+hybrids+through+cross+pollination+and+embryo+rescue+technique.">Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique.</a> World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).</li><li>Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+advanced+interspecific-bridge+lines+among+Cucurbita+pepo,+C.+maxima,+and+C.+moschata.">Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata.</a> HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).</li><li>Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+four+cucurbit+viruses+in+Cucurbita+moschata.">Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata.</a> Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).</li><li>Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+marker-assisted+pyramiding+of+genes+for+resistance+to+zucchini+yellow+mosaic+virus+in+oilseed+pumpkin+(Cucurbita+pepo).">Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo).</a> Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).</li><li>Hayase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cucurbita-crosses.+XV.+Flower+pollination+at+4+am+in+the+production+of+C.+pepo+x+C.+moschata+F1+hybrids.">Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids.</a> Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).</li><li>Reed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+rescue.">Embryo rescue.</a> Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).</li><li>Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+rescue+in+plants-a+review.">Embryo rescue in plants-a review.</a> Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).</li><li>Wall, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+hybrids+of+Cucurbita+obtained+by+embryo+culture.">Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture.</a> Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).</li><li>Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+cross+between+Cucurbita+pepo+L.+and+Cucurbita+martinezii+through+in+vitro+embryo+culture.">Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture.</a> Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).</li><li>Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+size+analysis+in+the+genus+Cucurbita+and+its+use+for+determination+of+interspecific+hybrids+obtained+using+the+embryo-rescue+technique.">Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique.</a> Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).</li><li>Giancaspro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+in+vitro+embryo+rescue+protocol+for+breeding+seedless+table+grapes+(Vitis+vinifera+L.)+in+Italy.">Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy.</a> Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).</li><li>Warchol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+genotype,+media+composition,+pH+and+sugar+concentrations+on+oat+(Avena+sativa+L.)+doubled+haploid+production+through+oat+x+maize+crosses.">The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).</li><li>Nepi, M., Pacini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pollination,+pollen+viability+and+pistil+receptivity+in+Cucurbita+pepo.">Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo.</a> Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).</li><li>Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+sensory+changes+during+development+and+storage+of+buttercup+squash.">Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash.</a> New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).</li><li>Moon, P., Meru, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+rescue+of+aged+Cucurbita+pepo+seeds+using+squash+rescue+medium.">Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium.</a> Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).</li><li>Nu&#241;ez-Palenius, H. G., Ram&#237;rez-Malag&#243;n, R., Ochoa-Alejo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muskmelon+embryo+rescue+techniques+using+in+vitro+embryo+culture.">Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture.</a> Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).</li><li>Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seed+development+and+seed+fill+in+hull-less+seeded+cultigens+of+pumpkin+(Cucurbita+pepo+L).">Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L).</a> Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).</li><li>Vining, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).</li></ol>

ישנם שני צווארי בקבוק עיקריים להכלאה בין-מינית מוצלחת בין C. moschata ו- C. pepo: מחסום תאימות צולבת, הנקבע על ידי היענות גנוטיפית לייצור עוברים היברידיים, ומחסומים לאחר ההפריה, המעכבים את התפתחותם של עוברים היברידיים לזרעים רגילים. כפי שדווח בעבר על דלעת, בדיקת התאימות הצולבת במחקר הנוכ?...

קוקורביטה (שם מדעי: Cucurbita; 2n = 40) הוא סוג מגוון מאוד במשפחת ה-Cucurbitaceae, הכולל 27 מינים שונים, מתוכם חמישה מבויתים1. מבין אלה, Cucurbita moschata, C. pepo, ו- C. maxima הם החשובים ביותר מבחינה כלכלית בעולם. בארה"ב, C. moschata ו- C. pepo הם שני המינים החשובים ביותר בייצור החקלאי. C. pepo מורכב מארבעה תת-מינים (ovifera, pepo, fraternal ו-gumala) המכילים קבוצות דלעת בקיץ ובחורף של נוכלים, סטרייטנק, בלוט, צדפות, קוקוזל, מח ירקות, קישואים ודלעת 2,3,4,5. C. moschata מורכב בעיקר מסוגי שוק דלעת חורף כולל דלורית, דיקינסון וקבוצת גבינה1. שני המינים מגוונים מבחינה מורפולוגית ופנוטיפית, כאשר C. pepo נחשב לתנובה שלו, לאוזניים, להרגל גידול השיחים ולתכונות פרי מגוונות הכוללות צורת פרי, גודל פרי, צבע בשר ותבנית קליפה. מאידך גיסא, C. moschata מוערך על הסתגלותו לחום ולחות, כמו גם עמידות למחלות ומזיקים 6,7. הכלאה בין-מינית בין C. moschata ו- C. pepo היא לא רק אסטרטגיה חשובה לאינטרוגרסיה של תכונות רצויות בין שני המינים, אלא גם מאפשרת את הרחבת הבסיס הגנטי בתוכניות רבייה 7,8.
הצלבות מוקדמות בין C. moschata ו- C. pepo נעשו כדי לקבוע את ההתאמה שלהם ו / או מחסומים טקסונומיים 9,10,11, בעוד שמחקרים מאוחרים יותר התמקדו בעיקר בהעברת תכונות רצויות12,13,14. הכלאה בין-מינית בין שני המינים התמקדה בהעברת תכונות חדשות כגון הרגל גידול של שיח או שיח למחצה ושיפור התשואה מ- C. pepo יחד עם עמידות למחלות, הסתגלות ללחץ אביוטי ומרץ מוגבר מ- C. moschata14,15,16. לדוגמה, הצלבות ספציפיות בין C. pepo (P5) ו- C. moschata (MO3) הביאו לתפוקת פירות גבוהה יותר 13, בעוד ש- C. moschata accessions (מקומי ניגרי ומנין) היו בשימוש נרחב כמקור העיקרי לעמידות בפני נגיפי פוטיוירוס בתרבויות C. pepo מעובדות 17,18. 
מחקרים קודמים הראו כי הכלאה בין C. moschata ו- C. pepo אפשרית אך קשה 8,15. הצלבים הבין-ספציפיים עלולים לגרום לכך שלא יהיו פירות (הפלה), פירות פרתנוקרפיים נטולי זרעים בני קיימא (זרעים ריקים), פירות ללא זרעים שבהם העוברים הלא בוגרים לא מצליחים להתפתח (stenospermocarpy), או פירות עם מעט עוברים לא בשלים שניתן להציל לצמחים בוגרים באמצעות הצלת עוברים15,16. לדוגמה, לא הושגו זרעים בני קיימא על ידי חציית C. pepo (מלכת השולחן, האם) עם C. moschata (גבינה גדולה, אבהית), עם זאת, הצלב ההדדי הניב 57 זרעים בני קיימא מתוך 134 האבקה9. הייאז השיגה זרעים בני קיימא מצלבי C. moschata ו- C. pepo רק כאשר צלבים נעשו בשעה 04:00 בבוקר באמצעות אבקה שאוחסנה בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס במשך הלילה19. באגט חצה שמונה זנים שונים של C. moschata עם C. pepo (דליקטה) ודיווח כי מתוך 103 האבקה כוללת, התקבלו 83 פירות שנראו תקינים, אך אף אחד מהם לא הכיל זרעים בני קיימא8. בהצלבה בין C. pepo (S179) ו- C. moschata (NK), Zhang et al. השיגו 15 פירות עם 2,994 זרעים, אך רק 12 מהם היו בני קיימא בעוד שהשאר הציגו התפתחות בסיסית בלבד. מחקרים אלה מצביעים על כך שלמרות שמעבר בין-ספציפי בין C. moschata ל- C. pepo מועיל מאוד, השגת פירות עם זרעים בני קיימא מהצלבים דורשת16.
הצלת עוברים הוצעה כשיטה מתאימה להתגבר על בעיות הנובעות מהפלה מוקדמת או מעוברים שפותחו בצורה גרועה והיא אחת הטכניקות המוקדמות והמוצלחות ביותר בתרבית במבחנה להתחדשות של עוברים לא בשלים16,20. הצלת עוברים כוללת תרבית מבחנה של עוברים לא מפותחים/לא בשלים ולאחר מכן העברה למדיום מזין סטרילי כדי להקל על התאוששות השתילים ובסופו של דבר צמחים בוגרים21. למרות שהצלת עוברים משמשת בדרך כלל בגידול סקווש, חסר תיאור מפורט של המתודולוגיה המתאימה שתאפשר את יישומה השגרתי. שימוש בטכניקת הצלת עוברים כדי להתגבר על מחסומי הכלאה בין-ספציפיים במיני Cucurbita דווח כבר בשנת 195422. עם זאת, ההצלחה של הצלת עוברים במחקרים המוקדמים לא דווחה או נמוכה מאוד. Metwally et al. דיווחו על שיעור הצלחה של 10% (התחדשות לצמחים בוגרים) בקרב 100 עוברים היברידיים בין-ספציפיים שניצלו מהכלאה בין C. pepo ו- C. martinezii23. Sisko et al. דיווחו על שיעור הצלחה משתנה של התחדשות עוברים בקרב עוברים שהתקבלו משילובים צולבים שונים: שיעור ההתחדשות של בני כלאיים שהושגו על ידי חציית C. maxima (Bos. Max) ו- C. pepo (הבהלה לזהב) היה 15.5%, עבור C. pepo (קישואים) ו- C. moschata (הוקאידו) היה 20%, ואילו עבור C. pepo (הבהלה לזהב) ו- C. moschata (דולגה) הוא היה 37.5%24. בנוסף לגנוטיפ, המדיה ותנאי התרבית במבחנה הם גורמים חשובים להצלחת הטכניקה25,26. במחקר הנוכחי נבדקו שילובי צלב שונים בין C. moschata ו- C. pepo, ופותחה מתודולוגיה פשוטה לשימוש בטכניקת הצלת העוברים בסקווש. פיתוח טכניקת הצלת עוברים פשוטה וקלה לשחזור תאפשר הכלאה בין-מינית ושיפור הנבטים בתוכניות גידול סקווש.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoclave</td>
			<td>Steris</td>
			<td>AMSCO LAB 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefotaxime</td>
			<td>Sigma Alfrich</td>
			<td>C 7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Sigma Alfrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detergent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol, 95%</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gellan gum</td>
			<td>Caisson Laboratories</td>
			<td>G024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>growth chamber or illuminated shelf</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminar hood / biosafety cabinet</td>
			<td>The Baker Company, Inc</td>
			<td>Edgegard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>masking tape</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-11735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>media bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M10200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NPK fertilizer (20-20-20)</td>
			<td>BWI Companies, Inc</td>
			<td>&#160;PR200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote Plus fertilizer</td>
			<td>BWI Companie,s Inc</td>
			<td>OS90590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma Alfrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>USA Scientific, Inc</td>
			<td>8609-0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plant pots</td>
			<td>BWI Companies, Inc</td>
			<td>NP4000BXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic food containers, reused</td>
			<td>Oscar Mayer</td>
			<td>4470003330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic hang tags</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07QTZRY6T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potting mix</td>
			<td>Jolly Gardener</td>
			<td>Pro-Line C/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seedling starter trays</td>
			<td>BWI Companies Inc</td>
			<td>GPPF128S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter (0.22 um )</td>
			<td>ExtraGene</td>
			<td>B25CA022-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trellis support</td>
			<td>The Home Depot</td>
			<td>&#160;2A060006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

embryo rescue protocol for interspecific hybridization in squash

הכלאה בין-מינית בגידולי קוקורביטה (סקווש) רצויה להרחבת השונות הגנטית ולאינטרוגרסיה של אללים שימושיים. עוברים לא בשלים הנוצרים מצלבים רחבים אלה חייבים להתחדש באמצעות טכניקות מתאימות להצלת עוברים. למרות שטכניקה זו מבוססת היטב עבור גידולים רבים, חסר תיאור מפורט של המתודולוגיה המתאימה לדלעת שתאפשר את יישומה השגרתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול הצלת עוברים שימושי להכלאה בין-מינית של C. pepo ו- C. moschata. כדי לזהות שילובים בני קיימא להצלת עוברים, בוצעו 24 צלבים בין-ספציפיים. סט פירות התקבל מעשרים ושניים צלבים, מה שמעיד על שיעור הצלחה של 92%. עם זאת, רוב הפירות שהתקבלו היו parthenocarpic, עם זרעים נטולי עוברים (זרעים ריקים). רק שילוב צלב אחד הכיל עוברים לא בשלים שניתן היה לחדשם באמצעות אמצעי גידול צמחיים בסיסיים. בסך הכל חולצו 10 עוברים מפרי F1 הבין-ספציפי, ושיעור ההצלחה של הצלת עוברים היה 80%. פרוטוקול חילוץ העוברים שפותח כאן יהיה שימושי להכלאה בין-מינית בתוכניות גידול סקווש.

כדאיות סט פירות וזרעים נערכה בדיקה ראשונית לקביעת כדאיות סט הפירות והזרעים במגוון שילובים צולבים. בסך הכל נבחרו 15 גנוטיפים של דלעת, ארבעה C. pepo ו-11 C. moschata, (טבלה 1). מתוך 24 צירופי הצלב הבין-ספציפיים שנוסו, הושגה ערכת פירות עבור 22 (טבלה 2), המייצגת הצלחה כול?...

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash at JoVE.com

Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash

המאמר מתאר פרוטוקול חילוץ עוברים להתחדשות של עוברים לא בשלים הנגזר מההכלאה הבין-מינית של Cucurbita pepo ו- Cucurbita moschata. ניתן לשכפל את הפרוטוקול בקלות והוא יהווה משאב חשוב לתוכניות גידול סקווש.

פרוטוקול הצלת עוברים להכלאה בין-מינית בסקווש

Interspecific hybridization in Cucurbita crops (squash) is desirable for widening genetic variation and for the introgression of useful alleles. Immature ...

פרוטוקול הצלת העוברים הוא חובה להתחדשות של עוברים לא בשלים שמקורם בהצלבות בין-מיניות בין מינים שונים של Cucurbita. הוא משמש בדרך כלל להצלבות בין Cucurbita moschata ו Cucurbita pepo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה.הפרוטוקול משתמש רק במדיית טרשת נפוצה עם אנטיביוטיקה. לפיכך, ניתן לשכפל אותו בקלות על ידי כל מעבדה. ניתן יהיה לשנות טכניקה זו כדי לחקור מחסומים שונים להכלאה בין-מינית או בין-גנרית.תשומת לב לפרטים במהלך כל שלב תועיל לתוצאה מוצלחת. התחילו בשתילת צמחי Cucurbita על ידי מילוי 50 תאים מתחילים שטוחים של 25 על 50 ס"מ באמצעות מדיום עציצים בתוספת חנקן מלא, זרחן ודשן אשלגן, המכיל 1.38 גרם לקילוגרם של חנקן, זרחן ואשלגן כל אחד. לאחר מכן, זורעים את הזרעים לעומק השווה לאורכם ומכסים אותם במדיום העציצים.להשקות את הדירות מבלי ליצור מים עומדים ולשמור על המדיה לחה על ידי השקייתן פעם ביום. בסוף שלב העלה האמיתי השני, השתלו את השתילים בעציצים בקוטר 30 ס"מ בתוספת שלוש כפות דשן שלם לכל סיר. לאחר כל שבעה ימים, להפרות כל סיר עם 500 מיליליטר של דשן נוזלי המכיל 20, 20, 20 חנקן, זרחן ואשלגן בגרם אחד הוסיף לגלון של מים.לשמור על צמחים בחממה בטמפרטורות שבין 22 ל 28 מעלות צלזיוס תחת משטר האור הטבעי. עבור גנוטיפים vining, לספק trellis תומך בחממה. בצעו הכלאה מבוקרת או האבקה ברגע שהצמחים מתחילים לפרוח בגיל שישה עד שמונה שבועות מהזריעה.בדקו את הפרחים שלא נפתחו בעלי גוון צהוב על עלי הכותרת, וזהו פרחים זכריים ופרחים נקביים של תרבויות Cucurbita pepo ו- Cucurbita moschata. כדי למנוע האבקה מקרית של חרקים, הדבק בעדינות את הפרח הסגור בחלקו העליון באמצעות סרט מיסוך. למחרת בבוקר, בצע את ההאבקה לפני 10:00 בבוקר על ידי הסרה עדינה של החלק העליון המודבק של הפרח הזכר והנקבה.הפרדת עלי הכותרת מהפרח הזכרי, והעברת האבקנים על ידי שפשוף עדין של הפתח על הסטיגמה של הפרח הנקבי. לאחר ההאבקה, סגרו מיד את הפרח הנקבי המואבק עם סרט מיסוך, והשתמשו בתג כדי לתעד את תאריך ההאבקה ולציין את ההורים האבהיים והאימהיים המשמשים בצלב. צלב מוצלח המסומן על ידי שחלה מורחבת יהווה פרי קטן תוך שבוע.קוטפים את הפרי לאחר 45 עד 55 ימי האבקה. הכינו ציר צ'פוטקסימה. סננו אותו דרך מסנן מזרק סטרילי בגודל 0.22 מיקרון.ולעשות 0.5 מיליליטר aliquots של 250 מיליגרם לכל מיליליטר cefotaxime לפני אחסון אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. באופן דומה, להכין מלאי אמפיצילין. מסננים אותו דרך מסנן מזרק סטרילי של 0.22 מיקרון ומכינים אליקוטים של מיליליטר אחד של 100 מיליגרם למיליליטר אמפיצילין לפני שמאחסנים אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס.הכינו את Murashige ו-Skoog, או MS medium על ידי המסת 2.45 גרם של המדיום ב-500 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק של ליטר אחד. הוסיפו 1.5 גרם של מסטיק גלן למדיום MS וסובבו אותו בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מצננים את המדיום על ידי הנחת הבקבוק באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.הפשירו את מלאי האנטיביוטיקה בתוך ארון הזרימה הלמינרית. מעבירים את הבקבוק הבינוני למכסה המנוע של הזרימה הלמינרית ומוסיפים 0.6 מיליליטר של מלאי cefotaxime ו-0.25 מיליליטר של מלאי אמפיצילין למדיום עם ערבוב נכון. יוצקים כשבעה מיליליטר של המדיום לתוך צלחת פטרי סטרילית סטרילית בגודל 60 על 15 מילימטרים.תנו למדיום להתמצק בצלחות הפטרי למשך כ-15 עד 20 דקות. סגרו את צלחות הפטרי בעטיפת איטום והכניסו אותן לקופסת אחסון בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף. קוטפים את פרי הדלעת על ידי כריתתו מהגפן הראשית ומחטאים את הפרי על ידי שטיפת פני השטח שלו בכיור המעבדה באמצעות חומר ניקוי נוזלי כמו 0.3% כלורוקסילנול.שטפו את הפרי במי ברז רבים ויבשו אותו במגבות נייר נקיות לפני העברת הפרי לארון זרימת האוויר למינציה. יש לעקר את משטח הפרי בתוך הארון על ידי ריסוס 70% אתנול. חותכים את הפרי בסכין סטרילית ומוציאים את הזרעים.השתמש במלקחיים סטריליים או בידיים עם כפפות סטריליות כדי לפתוח באופן אספטי את שכבת הזרעים ולחשוף את העוברים הלא בשלים לפני הנחתם בצלחת פטרי המכילה MS Medium בתוספת אנטיביוטיקה. אטמו את לוחות הפטרי באמצעות סרט עטיפה והניחו אותם בתא גידול בעל טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, תקופת צילום של 16 שעות ולחות יחסית של 70%. במקרה של זיהום, מיד תת-תרבות העוברים הלא מזוהמים לתוך צלחת חדשה בעלת אותו מדיום.לאחר פיתוח שורשים לאחר 10 עד 14 יום, והקוטילדונים מפותחים לאחר 15 עד 21 יום, הוציאו את הצמחים מהכלים הפטריים, ושטפו בעדינות את המדיה הקיימת סביב השורשים באמצעות מי ברז. מניחים צמחים מנוקים במיכל פלסטיק בגודל 14 על 9 על 4 ס"מ ומכסים את השורשים במגבות נייר רטובות. מכסים את המיכל ומרטיבים מחדש את מגבות הנייר בעת הצורך.הקפידו על מיכלי הפלסטיק בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס, ובפרק זמן של 16 שעות כדי להתאקלם בצמחים תוך שמירה על מצב הלחות של מגבות נייר. לאחר 7 עד 10 ימים של התאקלמות, מעבירים את השתילים באורך שלושה עד ארבעה סנטימטרים ל-50 תאים המכילים תערובת עציצים מסחרית מתוקנת עם דשן ומעבירים אותם לחממה. יש להימנע מהשקיית יתר כדי למנוע ריקבון ולהוסיף כ-10 עד 20 מיליליטר מים לתא לפי הצורך.בשלב השני עד השלישי של העלים, משתילים את השתילים לעציצים בקוטר 25 ס"מ מלאים במדיום עציצים מתוקן בדשן ומבצעים הכלאה מבוקרת כאשר הצמחים מתחילים לפרוח. שמרו על הצמחים בחממה בטמפרטורה של 22 עד 28 מעלות צלזיוס תחת משטר האור הטבעי. ולהעריך את הצמחים עבור תכונות פירות וזרעים.ארבעה פפו קוקורביטה ו-11 קוקורביטה מושצ'טה נבחרו להכלאה בין-מינית. מתוך 24 צירופי צלב בין-ספציפיים שנוסו, הושגה ערכת פירות עבור 22 צלבים המייצגים יותר מ-92% הצלחה בערכת הפירות. ההצלבות בין Cucurbita moschata ו- Cucurbita pepo המערבות גנוטיפים O ו- M, וגנוטיפים E ו- J, לא הניבו פרי בוגר.ואילו ההכלאה בין Cucurbita moschata לבין Cucurbita pepo שכללה גנוטיפים F ו-J, הניבה שישה פירות. מספר הפרחים המואבקים עבור שילובי צלב שונים נע בין 1 ל -11. ושיעור ההצלחה של ההאבקה נע בין 0% ל-100% מתוך 44 פירות שהופקו מכל צירופי הצלב, רק פרי אחד מהכלאה בין Cucurbita moschata ו-Cucurbita pepo, גנוטיפים C ו-J יצרו עוברים לא בשלים שניתן להציל.לצורך פיתוחם של עוברים לא מפותחים אלה, הם גודלו בתרבית באמצעות המדיה להצלת עוברים, מה שהביא לאחוזי הצלחה של 80% בהצלת עוברים. שני ההליכים החשובים ביותר הם זיהוי הצלבות תואמות בין שני מינים כלומר, Cucurbita moschata ו- Cucurbita pepo, והתחדשות עוברים מוצלחת. מכיוון שטכניקת הצלת העוברים היא פשוטה וניתנת לשכפול בקלות, מגדלי סקווש ברחבי העולם יכולים להשתמש בטכניקה זו להצלת עוברים לא בשלים שמקורם בהצלבות בין-ספציפיות בין מיני Cucurbita שונים.

Research

JoVE Journal

Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Non-רדיואקטיבי באתרו הכלאה פרוטוקול ישים עבור נורווגיה Spruce ומגוון של מיני צמחים

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...