Name: viral transgene expression in rodent hearts and the assessment of cardiac arrhythmia risk
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00
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Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 e PJT-180533, a WL), dal CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, a WL), dalla borsa di studio McDonald della Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) e dal New Investigator Award (S-17-LI-0866, a WL), borse di studio per studenti (a JW e YX) e una borsa di studio post-dottorato (ad AL) dall'Università di Ottawa Cardiac Endowment Funds presso l'Heart Institute. Gli autori ringraziano Richard Seymour per il suo supporto tecnico. La Figura 2 è stata creata con Biorender.com con licenze approvate.

Tutti i metodi e le procedure descritti sono stati approvati dal comitato di revisione etica della ricerca animale presso l'Università di Ottawa e dal comitato di revisione della biosicurezza presso l'Heart Institute dell'Università di Ottawa. I protocolli di sicurezza sviluppati includono che tutte le procedure relative all'adenovirus ricombinante o al virus adeno-associato (AAV) sono state eseguite in un armadio di biosicurezza di livello II. Tutti gli oggetti a contatto con il virus sono stati completamente decontam...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-specific+deletion+of+&#946;-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction.">Cardiomyocyte-specific deletion of &#946;-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5/BDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).</li><li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+Nod1/RIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance.">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li><li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-&#954;B+activation+and+atherogenesis+in+mice.">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-&#954;B activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li><li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm.">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).</li><li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na++channel+inhibition+by+Wnt+signalling.">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li><li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phosphoinositide+3-kinase+{alpha},+protein+kinase+C,+and+L-type+Ca2++channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility.">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li><li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18.">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li><li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies.">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).</li><li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit:+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy.">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li><li>Ionta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHOX2+overexpression+favors+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+pacemaker+cells,+improving+biological+pacing+ability.">SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).</li><li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length,+pacing+site+and+atropine.">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li><li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts.">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li><li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes.">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).</li><li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li><li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes:+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state.">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).</li><li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart.">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li><li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering.">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research:+Promises+and+challenges.">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).</li><li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block:+The+battle+for+tomorrow+has+begun.">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).</li><li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).</li><li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction.">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li><li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells.">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010 (2020).</li></ol>

Diversi passaggi sono fondamentali per il successo della preparazione cardiaca isolata e perfusa da Langendorff. In primo luogo, è importante evitare qualsiasi danno al cuore durante la raccolta del cuore (ad esempio, a causa di spremitura accidentale o taglio con le forbici). In secondo luogo, è fondamentale mettere il cuore raccolto in una soluzione fredda di Tyrode il prima possibile perché questo fermerà il battito cardiaco e ridurrà il consumo di ossigeno del cuore. In terzo luogo, l'inserimento dell'ago nell'a...

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo, causando la morte di 18 milioni di persone nel solo 20171. I roditori, in particolare topi e ratti, sono diventati il modello più comunemente usato nella ricerca cardiovascolare a causa della facilità di manipolazione e della disponibilità di varie linee di sovraespressione transgenica o knockout. I modelli di roditori sono stati fondamentali per comprendere i meccanismi della malattia e per identificare potenziali nuovi bersagli terapeutici nell'infarto miocardico2, nell'ipertensione3, nell'insufficienza cardiaca4 e nell'aterosclerosi5. Tuttavia, l'uso dei roditori negli studi sulle aritmie cardiache è limitato dalle loro piccole dimensioni del cuore e dalla frequenza cardiaca più veloce rispetto ai modelli umani o animali di grandi dimensioni. Pertanto, le aritmie letali spontanee nei topi o nei ratti dopo infarto miocardico sono rare2. I ricercatori sono costretti a concentrarsi su cambiamenti secondari indiretti che potrebbero riflettere un substrato pro-aritmico, come la fibrosi o l'espressione genica, senza mostrare cambiamenti significativi nel carico di aritmia o tendenze pro-aritmiche. Per superare questa limitazione, nel presente protocollo è descritto un metodo che consente una valutazione affidabile della suscettibilità dei cuori di topo e ratto alle tachiaritmie ventricolari dopo modificazione genetica 6,7 o infarto miocardico2. Questo metodo combina la stimolazione del recettore adrenergico con la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari in8 cuori isolati di topo e ratto permeati da Langendorff.
Gli approcci standard per il trasferimento genico virale nel tessuto miocardico dei roditori spesso comportano l'esposizione del cuore mediante toracotomia 9,10,11, che è una procedura invasiva ed è associata a un ritardo nel recupero degli animali dopo la procedura. Questo articolo descrive un metodo di iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida di imaging ecografico per la sovraespressione dei transgeni. Questa procedura meno invasiva consente un recupero più rapido dell'animale dopo l'iniezione virale e meno lesioni tissutali, rispetto alla toracotomia, riduce il dolore post-operatorio e l'infiammazione nell'animale e, quindi, consente una migliore valutazione degli effetti dei geni transgenici sulla funzione cardiaca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G 1/2 PrecisionGlide Needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adeno-associated virus (AAV9-GFP)</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenovirus (Ad-GFP)</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adenovirus (Ad-Wnt3a)</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>ADV-276318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet (Level II)</td>
			<td>Microzone Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model #: BK-2-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Vetergesic</td>
			<td>DIN 02342510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clipper</td>
			<td>WAHL Clipper Corporation</td>
			<td>78001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20701</td>
			<td>705 LT, volume 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Life Brand</td>
			<td>E12107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>DIN 02264315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fresenius Kabi Ltd.</td>
			<td>M60303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1351005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart 8 software</td>
			<td>ADInstruments Inc.</td>
			<td>Version 8.1.5</td>
			<td>for ECG recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (Ctnnb1flox/flox)</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>4152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (&#945;MHC-MerCreMer)</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS400 transducer</td>
			<td>VisualSonic Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Systane</td>
			<td>DIN 02444062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure meter</td>
			<td>NETECH</td>
			<td>DigiMano 1000</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-77924-65</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat (Sprague-Dawley, male)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10007-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Down Inc.</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>for Langendorff system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal ECG system</td>
			<td>ADInstruments Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>567530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MyoPacer EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO3100 Preclinical Imaging System</td>
			<td>VisualSonic Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral transgene expression in rodent hearts and the assessment of cardiac arrhythmia risk

Le malattie cardiache sono la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo. A causa della facilità di manipolazione e dell'abbondanza di ceppi transgenici, i roditori sono diventati modelli essenziali per la ricerca cardiovascolare. Tuttavia, le aritmie cardiache letali spontanee che spesso causano mortalità nei pazienti con malattie cardiache sono rare nei modelli di roditori di malattie cardiache. Ciò è dovuto principalmente alle differenze di specie nelle proprietà elettriche cardiache tra uomo e roditori e rappresenta una sfida per lo studio delle aritmie cardiache utilizzando i roditori. Questo protocollo descrive un approccio per consentire un'espressione transgenica efficiente nel miocardio ventricolare di topo e ratto utilizzando iniezioni intramuscolari guidate da ecocardiografia di virus ricombinante (adenovirus e virus adeno-associati). Questo lavoro delinea anche un metodo per consentire una valutazione affidabile della suscettibilità cardiaca alle aritmie utilizzando cuori di topo e ratto isolati e perfusi da Langendorff con stimolazioni elettriche sia adrenergiche che programmate. Queste tecniche sono fondamentali per lo studio dei disturbi del ritmo cardiaco associati al rimodellamento cardiaco avverso dopo lesioni, come l'infarto del miocardio.

Quando perfuso seguendo il protocollo qui descritto (Figura 1), un cuore isolato di ratto o topo batte ritmicamente e stabilmente per almeno 4 ore. Se il disegno sperimentale richiede un periodo più lungo di perfusione cardiaca, è utile aggiungere albumina nella soluzione di perfusione per ridurre l'insorgenza di edema miocardico dopo perfusione a lungo termine14. L'inclusione di isoproterenolo nella soluzione di perfusione imita l'attivazione del sistema nervoso si...

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Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Il presente protocollo descrive i metodi per l'espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.

Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Questo protocollo consente all'utente di ottenere un'espressione transgenica efficiente nel miocardio ventricolare, facilitando gli studi di espressione genica per esaminare le aritmie cardiache e la funzione nel tessuto ventricolare. La tecnica per l'espressione del transgene virale è minimamente invasiva per l'animale, causando meno danni e tempi di recupero ridotti rispetto agli approcci convenzionali che comportano una toracotomia. La tecnica per indurre aritmie nei cuori di piccoli roditori è utile per valutare la suscettibilità alle aritmie in piccoli modelli animali di malattie cardiache.A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Alice Lu, borsista post-dottorato del laboratorio. Per iniziare, sterilizzare la regione inferiore sinistra del torace del topo anestetizzato con cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina, in alcool, tre volte con un movimento circolare. Sotto guida ecografica, inserire l'ago della siringa contenente il virus nel torace dell'animale.Avvicinare la punta dell'ago nella parete libera anteriore ventricolare sinistra e iniettare lentamente da 10 a 15 microlitri del virus. Verificare la riuscita dell'iniezione nelle immagini ecografiche grazie alla maggiore luminosità vicino alla punta dell'ago. Prelevare l'ago dal cuore e inserirlo in altre regioni del ventricolo sinistro per una seconda e terza iniezione della stessa quantità di virus.Per eseguire la perfusione Langendorff del cuore del topo, posizionare il cuore cannulato in un piatto di plastica rivestito in silicone elastomero da 10 centimetri, con il ventricolo sinistro rivolto verso l'alto. Cannulare l'aorta del cuore con un ago smussato collegato a un sistema di profusione Langendorff modificato in modalità a portata costante. Perfondere il cuore con la soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius.All'inizio della perfusione, verificare il corretto incannulamento aortico osservando il lavaggio del sangue dal cuore durante i primi due o tre battiti cardiaci e cambiando il colore del cuore da rosso a pallido. Regolare la portata per mantenere la pressione di perfusione a 70-80 millimetri di mercurio. Dopo la conferma, posizionare gli elettrodi di un piccolo sistema ECG animale attorno al cuore inserendoli nel rivestimento in elastomero siliconico nel piatto.Quindi, registrare l'ECG utilizzando un software compatibile. Quindi, eseguire la stimolazione del recettore adrenergico e perfondere il cuore con isoproterenolo e soluzione di Tyrode. Dopo 10 minuti, eseguire la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari stimolando il cuore all'apice con due elettrodi di platino collegati a uno stimolatore elettrico.Inizia la procedura di stimolazione con 10 stimoli iniziali consecutivi, S1, seguiti da uno stimolo extra, S2, con un intervallo iniziale di 80 millisecondi. Quindi, ridurre ripetutamente l'intervallo S2 di due millisecondi ogni volta fino a quando il battito cardiaco non può più essere catturato o viene raggiunto il periodo refrattario effettivo del cuore, o ERP. Monitorare eventuali tachiaritmie ventricolari indotte, incluse tachicardia ventricolare e fibrillazione, mediante ECG.Se non vengono indotte aritmie. aggiungere un altro stimolo extra, S3, dopo S2, con gli stessi parametri fino al raggiungimento dell'ERP. Se le tachiaritmie ventricolari non sono ancora indotte, interrompere la stimolazione elettrica e considerare il cuore non inducibile.Durante la stimolazione elettrica programmata, il successo della stimolazione cardiaca viene verificato dalla cattura uno-a-uno del battito cardiaco durante gli stimoli S1 consecutivi e dal complesso QRS prolungato durante la stimolazione S1. Queste stimolazioni combinate adrenergiche ed elettriche non hanno indotto tachiaritmie ventricolari in cuori di topo selvatici sani e finti o in cuori di ratto iniettati con adenovirus-GFP di controllo. Al contrario, lo stesso protocollo ha indotto tachiaritmie ventricolari nel 77% dei cuori di topo wild-type dopo infarto miocardico e in tre ratti su quattro dopo iniezione intramiocardica di Ad-Wnt3a.Durante l'inserimento dell'ago, assicurarsi che la punta dell'ago sia incorporata all'interno della parete libera e non all'interno del ventricolo. Inoltre, fissare e incannulare l'aorta del cuore è il passo più critico. Seguendo queste procedure, i cuori possono essere utilizzati per studi istologici standard o saggi di biologia molecolare.In alternativa, le cellule vive possono essere isolate per eseguire studi di elettrofisiologia a singola cellula.

Research

JoVE Journal

Biology

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

Espressione mirato di GFP nel follicolo pilifero Utilizzando Ex trasduzione virale Vivo

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Ricerca

Biologia

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Semiautomatici Analisi Heartbeat ottica di piccoli cuori

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Valutazione di espressione GFP e sostenibilità Utilizzando la Image-Based Tali Citometro

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Sintesi di mRNA modificata per l&#39;induzione di espressione della proteina nelle cellule umane

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...