Name: reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Grant nr. R01 GM-130934 og National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. og K.S.C. blev delvist støttet af et tilskud fra National Institute of General Medical Sciences under tildeling T32 GM119999.

BEMÆRK: Dannelse af understøttede lipiddobbeltlag kræver fremstilling af monodisperserede små unilamellare vesikler (SUV'er). Der henvises til en tidligere offentliggjort protokol24 om SUV-dannelse. Kort fortalt dannes alle SUV'er ved sondesonikering i 12 minutter i alt ved 70% amplitude via 4 minutters sonikeringsperioder efterfulgt af 2 minutters hvileperioder i isvand. SUV-løsninger skal være godt afklaret og monodisperseret i størrelse. Størrelsesfordelinger af SUV'er kan måles, for e...

<ol>
	<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature+and+spatial+organization+in+biological+membranes.">Curvature and spatial organization in biological membranes.</a> Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).</li><li>Mao, Y., Baum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug+of+war-The+influence+of+opposing+physical+forces+on+epithelial+cell+morphology.">Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology.</a> Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).</li><li>Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+organization+in+mixed+lipid+membranes+driven+by+intrinsic+curvature+difference.">Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).</li><li>Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArfGAP1+responds+to+membrane+curvature+through+the+folding+of+a+lipid+packing+sensor+motif.">ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif.</a> The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).</li><li>Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+lateral+diffusion+of+dipalmitoylphosphatidylcholine+adsorbed+on+silica+beads+in+the+absence+and+presence+of+melittin:+A+31P+two-dimensional+exchange+solid-state+NMR+study.">Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study.</a> Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).</li><li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+nanoparticle+supported+lipid+bilayers+for+the+structural+study+of+membrane+geometry-sensitive+molecules.">Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).</li><li>Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sub-nanometre+view+of+how+membrane+curvature+and+composition+modulate+lipid+packing+and+protein+recruitment.">A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment.</a> Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).</li><li>Gill, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein.">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li><li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix.">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li><li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes.">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li><li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size.">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).</li><li>Ferhan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonic+sensing+architectures+for+decoding+membrane+curvature-dependent+biomacromolecular+interactions.">Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions.</a> Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Lou, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography.">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li><li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes.">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li><li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amphipathic+helix+enables+septins+to+sense+micrometer-scale+membrane+curvature.">An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature.</a> Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).</li><li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+of+supported+bilayer+formation+probed+by+single+vesicle+fluorescence+assays.">Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li><li>Lobato-M&#225;rquez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+bacterial+entrapment+by+septin+cage+reconstitution.">Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution.</a> Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).</li><li>Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cortex+at+the+yeast+mother-bud+neck.">The septin cortex at the yeast mother-bud neck.</a> Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).</li><li>Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+dynamic+remodelling+of+the+septin+cytoskeleton+during+the+cell+cycle.">Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle.</a> Nature Communications. 5, 1-10 (2014).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers.">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li><li>Hupfeld, S., Hols&#230;ter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+size+analysis+by+dynamic/static+light+scattering+upon+size+exclusion-/field+flow-fractionation.">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).</li><li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies.">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li><li>Woods, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+governing+septin+assembly.">Biophysical properties governing septin assembly.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Cannon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism.">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Reimhult, E., H&#246;&#246;k, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution:+Influence+of+surface+chemistry,+vesicle+size,+temperature,+and+osmotic+pressure.">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li><li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces:+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction.">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li><li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+lipid+bilayers+(SLBs)+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts.">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li><li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes:+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane.">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li><li>Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li></ol>

Cellemembraner antager mange forskellige former, krumninger og fysisk-kemiske egenskaber. For at studere det nanometer-skala maskineri, hvorigennem celler bygger mikrometerskalasamlinger, er det nødvendigt at designe minimale rekonstitutionssystemer af membranmimetik. Denne protokol præsenterer teknikker, der præcist styrer både membrankrumning og sammensætning, samtidig med at brugeren let kan foretage kvantitative fluorescensmålinger ved hjælp af bredt tilgængelige mikroskopiteknikker.
<p class="jove_conten...

Cellernes former og mange af deres indre rum er afhængige af lipidmembranerne, der omgiver dem. Membraner er viskoelastiske strukturer, der kan deformeres gennem interaktioner med proteiner, lipidsortering og virkende interne og eksterne kræfter for at generere en række forskellige former 1,2,3,4. Disse former beskrives ofte med hensyn til membrankrumning. Celler bruger en forskelligartet række proteiner, der er i stand til fortrinsvis at samle sig på eller "sensere" bestemte membrankrumninger for at sikre defineret spatio-temporal kontrol over processer, herunder cellehandel, cytokinese og migration 5,6. Dynamikken i cellemaskiner ved membranen er især vanskelig at observere på grund af vanskeligheden ved at afbalancere tid og rumlig opløsning med cellesundhed. Mens superopløsningsteknikker kan give et detaljeret overblik over sådanne strukturer, kræver de lange erhvervelser, der ikke er modtagelige for tidsskalaerne for montering / demontering for de fleste maskiner. Derudover gør den molekylære kompleksitet af disse samlinger i deres oprindelige miljø og de mange roller, som en enkelt komponent kan spille, minimale rekonstitutionssystemer til et værdifuldt værktøj til at studere molekylernes funktionelle kapacitet.
Minimal membranmimetik er udviklet til at studere membranegenskaber og protein-membran-interaktioner uden for cellen. Membranmimetik varierer fra fritstående lipiddobbeltlag, såsom liposomer eller gigantiske unilamellare vesikler, til understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er)7,8,9,10. SLB'er er biomimetiske membraner forankret til underliggende støtte, typisk sammensat af glas, glimmer eller silica11,12. En række geometrier kan anvendes, herunder plane overflader, kugler, stænger og endda bølgende eller mikropatternede substrater til at sonde protein-membraninteraktioner på både konkave og konvekse krumninger samtidigt1 3,14,15,16,17,18 . Dannelse af dobbeltlag begynder med vesikeladsorption på en hydrofil overflade efterfulgt af fusion og brud til dannelse af et kontinuerligt dobbeltlag (figur 1)19. Understøttede dobbeltlag er særligt modtagelige for lys og elektronmikroskopi, hvilket giver både bedre tid og rumlig opløsning, end det ofte kan opnås i celler. Buede SLB'er giver især et attraktivt middel til at undersøge proteinkrumningsfølsomhed i fravær af signifikant membrandeformation, hvilket gør det muligt at skelne mellem krumningsføler og krumningsinduktion, som ofte er umulige at adskille i fritstående systemer.
Septiner er en klasse af filamentdannende cytoskeletale proteiner, der er kendt for deres evne til at samle sig på positivt buede membraner 6,18,20. I løbet af cellecyklussen i gær samles septiner til en ring og skal omarrangeres for at danne timeglas- og dobbeltringstrukturer forbundet med henholdsvis knopspiring og cytokinese21. Mens smukt arbejde er blevet udført ved hjælp af platin replika elektronmikroskopi til at observere septin arkitektur på varierende cellecyklus trin22, har se septin samling over tid ved hjælp af lysmikroskopi i gær mødt med begrænset rumlig opløsning. Tidligere arbejde med septiner ved hjælp af lipidmonolag visualiseret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) var i stand til at rekonstruere flere interessante septinstrukturer såsom ringe, bundter og gasbind23. Imidlertid er EM-teknikker ligeledes begrænset i deres tidsmæssige opløsning, i modsætning til fluorescensmikroskopi. For bedre at løse de kinetiske parametre for septinsamlingsprocessen i flere skalaer vendte vi os til understøttet membranmimetik, hvor man omhyggeligt kan kontrollere membrangeometri, prøvebetingelser og billeddannelsesmodalitet.
Protokollerne beskrevet her bruger plane eller buede SLB'er, renset protein og en kombination af mikroskopiteknikker. Kvantitativ fluorescens konfokal mikroskopi og total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM) blev brugt til at måle både bulkproteinbinding på forskellige membrankrumninger samt til at måle bindingskinetikken af enkeltmolekyler. Desuden er denne protokol blevet tilpasset til brug med scanningselektronmikroskopi (SEM) til at undersøge protein ultrastruktur på forskellige membrankrumninger. Mens fokus for disse protokoller er på septincytoskelettet, kan protokollerne let ændres for at undersøge krumningsfølsomheden for ethvert protein, som læseren finder interessant. Derudover kan de, der arbejder inden for områder som endocytose eller vesikulær handel, finde disse teknikker nyttige til sondering af krumningsafhængige samlinger af multiproteinkomplekser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural</td>
			<td>Watson</td>
			<td>137-211C(EX)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL low adhesion tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4612-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for making PEGylated coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152450</td>
			<td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Liss Rhodamine PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Sodium Cacodylate Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M052-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglass coverslips for planar bilayers</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>22x22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Functionalized Silica Microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratories, Inc.</td>
			<td>Depends on size: SS0200*-SS0500*</td>
			<td>Silica in aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Thorlabs</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>Flexible adhesive for glass or plastics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20816-12-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-25</td>
			<td>Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0395-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverglass, #1.5 12mm&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td>Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy PI</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>ENF-260C</td>
			<td>115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanGlass Microfiber Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28455-030</td>
			<td>42.5 mm diameter, Grade GF/C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions

De fleste celler kan sanse og ændre deres form for at udføre grundlæggende celleprocesser. I mange eukaryoter er septincytoskelettet en integreret komponent i koordinering af formændringer som cytokinese, polariseret vækst og migration. Septiner er filamentdannende proteiner, der samles for at danne forskellige højere ordensstrukturer og i mange tilfælde findes i forskellige områder af plasmamembranen, især i områder med mikronskala positiv krumning. Overvågning af processen med septinsamling in vivo hindres af begrænsningerne ved lysmikroskopi i celler samt kompleksiteten af interaktioner med både membraner og cytoskeletale elementer, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere septindynamik i levende systemer. Heldigvis har der været betydelige fremskridt i det sidste årti med at rekonstituere septincytoskelettet i et cellefrit system for at dissekere de mekanismer, der styrer septinsamling ved høje rumlige og tidsmæssige opløsninger. Kernetrinnene i septinsamling inkluderer septin heterooligomerassocilation og dissociation med membranen, polymerisation i filamenter og dannelse af højere ordensstrukturer gennem interaktioner mellem filamenter. Her præsenterer vi tre metoder til at observere septinsamling i forskellige sammenhænge: plane dobbeltlag, sfæriske understøtninger og stangstøtter. Disse metoder kan anvendes til at bestemme de biofysiske parametre for septiner på forskellige stadier af samlingen: som enkeltoktomerer, der binder membranen, som filamenter og som samlinger af filamenter. Vi bruger disse parametre parret med målinger af krumningsprøvetagning og præferenceadsorption for at forstå, hvordan krumningsføling fungerer i forskellige længder og tidsskalaer.

Efter fremstillingen af hver SLB kan septiner eller proteinet af interesse inkuberes med den ønskede støtte og afbildes via TIRFM, konfokal mikroskopi eller SEM. Resultaterne vist her bruger septiner rekombinant udtrykt og renset fra E. coli17. Ved hjælp af TIRFM på plane SLB'er er det muligt at bestemme længden af filamenter og deres fleksibilitet, måle diffusionskoefficienterne og observere samling over tid28,29. For at in...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions at JoVE.com

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Cellefri rekonstitution har været et vigtigt værktøj til at forstå cytoskeletsamlingen, og arbejdet i det sidste årti har etableret tilgange til at studere septindynamik i minimale systemer. Præsenteret her er tre komplementære metoder til at observere septinsamling i forskellige membrankontekster: plane dobbeltlag, sfæriske understøtninger og stangstøtter.

Rekonstitution af Septin-samling ved membraner for at studere biofysiske egenskaber og funktioner

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Denne protokol vil guide dem, der arbejder med membranbindende proteiner til at bestemme, hvordan membranform spiller en rolle i organisationen af proteinsamlinger. Den primære fordel ved denne teknik er dens alsidighed for proteintype, membransammensætning og membrangeometri. Det tillader også forhør af, hvordan et lipiddobbeltlag kan ændre egenskaberne af associerede proteiner.For at identificere en god membran til eksperimentet foreslår vi at etablere en tjekliste, der kan omfatte lipiddiffusionshastigheder, mobilitet af det interessante protein, og om der er uburst liposomer eller smeltede liposomer fast på overfladen. For at begynde plasmarensning af diasene skal du rense plasmarenseren i fem minutter med ilt for at fjerne luft fra linjerne og kammeret. Arranger tørre dækglas glider ind i en keramisk vugge.Under rensning skal du strømme en inert gas over mikrodækselglasgliderne for at fjerne støv og partikler. Placer vuggen bag på plasmakammeret, så dækslerne er parallelle med kammerets lange kant. Kør plasmarenseren i 15 minutter med ilt ved maksimal effekt.Til kammerforberedelse skal du afskære hætten lige under den frostede del af et 0,2 ml PCR-rør. Mal kanten af PCR-røret med UV-aktiveret klæbemiddel, så du undgår indersiden af røret. Placer forsigtigt PCR-rørlimen ned i midten af en plasmarenset dæksel, og placer derefter kammeret under UV-lys med lang bølgelængde i fem til syv minutter for at hærde klæbemidlet.For at danne et dobbeltlag tilsættes reagenserne til brønden. Ryst forsigtigt kamrene fra side til side for at forstyrre SUV'erne og inkuber derefter ved 37 grader Celsius i 20 minutter. Efter inkubation skylles dobbeltlaget seks gange med 150 mikroliter SLBB ved at pipettere for at vaske overskydende lipider væk, og vask derefter dobbeltlaget seks gange med 150 mikroliter reaktionsbuffer, inden det inkuberes med septinerne.På det sidste vasketrin skal du fjerne reaktionsbufferen og efterlade 75 mikroliter i brønden. Tilsæt 25 mikroliter septiner fortyndet i SSB og billede ved TIRF-mikroskopi. Først hvirvles flasken indeholdende silicamikrosfærer i 15 sekunder, derefter badesonikat i et minut og hvirvel igen i 15 sekunder for at bryde eventuelle klynger.Bland perlerne med SLBB og 10 mikroliter fem millimolar SUV'er i et mikrocentrifugerør med lav vedhæftning. Inkuber perlelipidblandingen i en time ved stuetemperatur på en ryster for at forhindre sedimentering. I mellemtiden optøes en pegyleret dæksel og limer et skåret 0,2 ml PCR-rør til det.Efter inkubation centrifugeres perlerne i 30 sekunder ved den udpegede RCF. Efter det første spin fjernes 50 mikroliter supernatant, tilsættes derefter 200 mikroliter PRB og blandes ved kraftig pipettering. Til de næste runder skal du fjerne 200 mikroliter PRB og tilføje yderligere 200 mikroliter efter det andet og tredje spin og tilføje 220 mikroliter PRB efter det fjerde spin.Hvis du laver et konkurrenceassay med flere perlestørrelser, skal du forberede reaktionen ved at blande lige store mængder af hver perlestørrelse og fortynde 29 mikroliter af denne perleblanding med 721 mikroliter reaktionsbuffer, tilsæt derefter 75 mikroliter fortyndede perler og 25 mikroliter protein fortyndet i SSB til brøndene og bland. Hvis du måler septiner i steady tilstand, inkuberes blandingen ved stuetemperatur i en time og derefter afbildes enten i nærheden af TIRF eller konfokal mikroskopi. TIRF-mikrografer af plane SLB'er inkuberet med septiner vist i grønt viste homogen proteinfordeling.SLB'er lavet med dårligt rengjorte glasdæksler viste huller eller huller i dobbeltlaget i områder med lavt septin. Unburst og tubulerede liposomer kan ophobes på overfladen, hvis der anvendes gamle liposomer, eller hvis vaske ikke er strenge. I mikrografer af lipidbelagte mikrosfærer visualiseret ved hjælp af rhodamin PE viste glat dobbeltlagsaflejring.De sfæriske understøtninger var jævnt belagt med membranen, og der var få perleklynger. Utilstrækkelig vask af overskydende lipider forårsagede ujævn membranbelægning som observeret af lipidklumper og forkert håndtering forårsagede huller i dobbeltlaget. Utilstrækkelig blanding af perler forårsagede klumpning, hvilket ikke er ideelt til måling af den samlede proteinabsorption.Ved hjælp af de understøttede lipiddobbeltlag, der præsenteres her, kan andre metoder såsom fluorescens levetidsbilleddannelsesmikroskopi, massecytometri af membraner og højhastigheds atomkraftmikroskopi udføres for at undersøge forskellige proteinprotein- eller proteinmembrandynamikker.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering af Intermediate Filament Proteiner fra Multiple Musvæv til Studie Aging-associerede Post-translationelle Modifikationer

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Små kolorimetriske Assays af intracellulære laktat og pyruvat i at ødelægge Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

En planarian motilitet assay at måle biomodulerende egenskaber af naturlige produkter

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Co-translationel indsættelse af membranproteiner i præformerede nanodiscs

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutronspektroskopi med høj opløsning til undersøgelse af picosekund-nanosekunddynamik af proteiner og hydreringsvand

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Oprensning og kvalitetskontrol af rekombinante septinkomplekser til cellefri rekonstitution

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...