Name: reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Grant no. R01 GM-130934 en National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. en K.S.C. werden gedeeltelijk ondersteund door een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences in het kader van de toekenning T32 GM119999.

OPMERKING: Het vormen van ondersteunde lipide bilayers vereist de bereiding van monodispersed kleine unilamellaire blaasjes (SUV's). Raadpleeg een eerder gepubliceerd protocol24 over SUV-formatie. Kortom, alle SUV's worden gevormd door sonde-sonicatie gedurende 12 minuten in totaal bij 70% amplitude via 4 minuten ultrasoonapparaatperioden gevolgd door 2 minuten rustperioden in ijswater. SUV-oplossingen moeten goed worden verduidelijkt en monodispersed in grootte. Grootteverdelingen van SUV's kunne...

<ol>
	<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curvature+and+spatial+organization+in+biological+membranes.">Curvature and spatial organization in biological membranes.</a> Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).</li><li>Mao, Y., Baum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug+of+war-The+influence+of+opposing+physical+forces+on+epithelial+cell+morphology.">Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology.</a> Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).</li><li>Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+organization+in+mixed+lipid+membranes+driven+by+intrinsic+curvature+difference.">Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).</li><li>Bigay, J., Casella, J. -. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArfGAP1+responds+to+membrane+curvature+through+the+folding+of+a+lipid+packing+sensor+motif.">ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif.</a> The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).</li><li>Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. J., Auger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+lateral+diffusion+of+dipalmitoylphosphatidylcholine+adsorbed+on+silica+beads+in+the+absence+and+presence+of+melittin:+A+31P+two-dimensional+exchange+solid-state+NMR+study.">Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study.</a> Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).</li><li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+nanoparticle+supported+lipid+bilayers+for+the+structural+study+of+membrane+geometry-sensitive+molecules.">Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).</li><li>Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sub-nanometre+view+of+how+membrane+curvature+and+composition+modulate+lipid+packing+and+protein+recruitment.">A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment.</a> Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).</li><li>Gill, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein.">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li><li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix.">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li><li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes.">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li><li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size.">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).</li><li>Ferhan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonic+sensing+architectures+for+decoding+membrane+curvature-dependent+biomacromolecular+interactions.">Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions.</a> Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).</li><li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments.">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li><li>Lou, H. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography.">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li><li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes.">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li><li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amphipathic+helix+enables+septins+to+sense+micrometer-scale+membrane+curvature.">An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature.</a> Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).</li><li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+of+supported+bilayer+formation+probed+by+single+vesicle+fluorescence+assays.">Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li><li>Lobato-M&#225;rquez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insight+into+bacterial+entrapment+by+septin+cage+reconstitution.">Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution.</a> Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).</li><li>Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+septin+cortex+at+the+yeast+mother-bud+neck.">The septin cortex at the yeast mother-bud neck.</a> Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).</li><li>Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+dynamic+remodelling+of+the+septin+cytoskeleton+during+the+cell+cycle.">Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle.</a> Nature Communications. 5, 1-10 (2014).</li><li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li><li>Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers.">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li><li>Hupfeld, S., Hols&#230;ter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+size+analysis+by+dynamic/static+light+scattering+upon+size+exclusion-/field+flow-fractionation.">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).</li><li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies.">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li><li>Woods, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+governing+septin+assembly.">Biophysical properties governing septin assembly.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Cannon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism.">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Reimhult, E., H&#246;&#246;k, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution:+Influence+of+surface+chemistry,+vesicle+size,+temperature,+and+osmotic+pressure.">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li><li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces:+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction.">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li><li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+supported+lipid+bilayers+(SLBs)+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts.">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li><li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes:+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane.">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li><li>Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li></ol>

Celmembranen nemen veel verschillende vormen, krommingen en fysisch-chemische eigenschappen aan. Om de machinerie op nanometerschaal te bestuderen waarmee cellen assemblages op micrometerschaal bouwen, is het noodzakelijk om minimale reconstitutiesystemen van membraanmi mimetica te ontwerpen. Dit protocol presenteert technieken die zowel de membraankromming als de samenstelling nauwkeurig regelen, terwijl de gebruiker eenvoudig kwantitatieve fluorescentiemetingen kan uitvoeren met behulp van algemeen beschikbare microsco...

De vormen van cellen en veel van hun interne compartimenten zijn afhankelijk van de lipidemembranen die hen omringen. Membranen zijn visco-elastische structuren die kunnen worden vervormd door interacties met eiwitten, lipidensortering en werkende interne en externe krachten om een verscheidenheid aan vormen te genereren 1,2,3,4. Deze vormen worden vaak beschreven in termen van membraankromming. Cellen gebruiken een gevarieerde reeks eiwitten die bij voorkeur kunnen assembleren op, of "detecteren", bepaalde membraankrommingen om gedefinieerde spatio-temporele controle over processen zoals celhandel, cytokinese en migratie te garanderen 5,6. De dynamiek van celmachines aan het membraan is met name moeilijk waar te nemen vanwege de moeilijkheid om tijd en ruimtelijke resolutie in evenwicht te brengen met de gezondheid van cellen. Hoewel superresolutietechnieken een gedetailleerd beeld van dergelijke structuren kunnen bieden, vereisen ze langdurige acquisities die niet geschikt zijn voor de tijdschalen van montage / demontage voor de meeste machines. Bovendien maken de moleculaire complexiteit van deze assemblages in hun oorspronkelijke omgeving en de veelheid aan rollen die een enkele component kan spelen, minimale reconstitutiesystemen een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de functionele capaciteit van moleculen.
Minimale membraan mimetica zijn ontwikkeld om membraaneigenschappen en eiwit-membraan interacties buiten de cel te bestuderen. Membraan mimetica variëren van vrijstaande lipide bilayers, zoals liposomen of gigantische unilamellaire blaasjes, tot ondersteunde lipide bilayers (SLBs)7,8,9,10. SWB's zijn biomimetische membranen verankerd aan onderliggende ondersteuning, meestal samengesteld uit glas, mica of silica11,12. Een verscheidenheid aan geometrieën kan worden gebruikt, waaronder vlakke oppervlakken, bollen, staven en zelfs golvende of micropatterned substraten om eiwit-membraaninteracties op zowel concave als convexe krommingen tegelijkertijdte onderzoeken 1 3,14,15,16,17,18 . Bilayer-vorming begint met adsorptie van blaasjes op een hydrofiel oppervlak, gevolgd door fusie en breuk om een continue bilayer te vormen (figuur 1)19. Ondersteunde bilayers zijn bijzonder vatbaar voor licht- en elektronenmicroscopie en bieden zowel een betere tijd als ruimtelijke resolutie dan vaak haalbaar is in cellen. Gebogen SWB's bieden vooral een aantrekkelijk middel om de gevoeligheid van eiwitkromming te onderzoeken bij afwezigheid van significante membraanvervorming, waardoor men onderscheid kan maken tussen krommingsdetectie en krommingsinductie, die vaak onmogelijk te scheiden zijn in vrijstaande systemen.
Septines zijn een klasse van filamentvormende cytoskeletale eiwitten die bekend staan om hun vermogen om te assembleren op positief gebogen membranen 6,18,20. In de loop van de celcyclus in gist verzamelen septines zich tot een ring en moeten ze zich herschikken om de zandloper- en dubbele ringstructuren te vormen die verband houden met knopopkomst en cytokinese, respectievelijk21. Hoewel er prachtig werk is gedaan met behulp van platina replica elektronenmicroscopie om septinearchitectuur te observeren in verschillende celcyclusstadia22, heeft het kijken naar septineassemblage in de loop van de tijd met behulp van lichtmicroscopie in gist een beperkte ruimtelijke resolutie ontmoet. Eerder werk aan septines met behulp van lipide monolagen gevisualiseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) was in staat om verschillende interessante septinestructuren zoals ringen, bundels en gaasjes te reconstitueren23. EM-technieken zijn echter ook beperkt in hun temporele resolutie, in tegenstelling tot fluorescentiemicroscopie. Om de kinetische parameters van het multischaalproces van septineassemblage beter op te lossen, wendden we ons tot ondersteunde membraan mimetica, waar men de membraangeometrie, monsteromstandigheden en beeldvormingsmodaliteit zorgvuldig kan regelen.
De hier beschreven protocollen maken gebruik van planaire of gebogen SLBs, gezuiverd eiwit en een combinatie van microscopietechnieken. Kwantitatieve fluorescentie confocale microscopie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) werden gebruikt om zowel bulkeiwitbinding op verschillende membraankrommingen te meten, als om de bindingskinetiek van afzonderlijke moleculen te meten. Bovendien is dit protocol aangepast om te worden gebruikt met scanning elektronenmicroscopie (SEM) om eiwit ultrastructuur op verschillende membraankrommingen te onderzoeken. Hoewel de focus van deze protocollen ligt op het septinecytoskelet, kunnen de protocollen eenvoudig worden aangepast om de krommingsgevoeligheid van elk eiwit te onderzoeken dat de lezer interessant vindt. Bovendien kunnen degenen die werkzaam zijn op gebieden zoals endocytose of vesiculaire handel deze technieken nuttig vinden voor het onderzoeken van de krommingsafhankelijke assemblages van multi-eiwitcomplexen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural</td>
			<td>Watson</td>
			<td>137-211C(EX)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL low adhesion tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4612-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for making PEGylated coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152450</td>
			<td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Liss Rhodamine PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Sodium Cacodylate Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M052-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglass coverslips for planar bilayers</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>22x22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Functionalized Silica Microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratories, Inc.</td>
			<td>Depends on size: SS0200*-SS0500*</td>
			<td>Silica in aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Thorlabs</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>Flexible adhesive for glass or plastics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20816-12-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-25</td>
			<td>Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0395-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverglass, #1.5 12mm&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td>Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy PI</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>ENF-260C</td>
			<td>115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanGlass Microfiber Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28455-030</td>
			<td>42.5 mm diameter, Grade GF/C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions

De meeste cellen kunnen hun vorm waarnemen en veranderen om fundamentele celprocessen uit te voeren. In veel eukaryoten is het septinecytoskelet een integraal onderdeel van het coördineren van vormveranderingen zoals cytokinese, gepolariseerde groei en migratie. Septines zijn filamentvormende eiwitten die zich verzamelen om diverse structuren van hogere orde te vormen en in veel gevallen worden aangetroffen in verschillende delen van het plasmamembraan, met name in regio's met een positieve kromming op micronschaal. Het monitoren van het proces van septineassemblage in vivo wordt belemmerd door de beperkingen van lichtmicroscopie in cellen, evenals de complexiteit van interacties met zowel membranen als cytoskeletale elementen, waardoor het moeilijk is om septinedynamiek in levende systemen te kwantificeren. Gelukkig is er in het afgelopen decennium aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het reconstitueren van het septinecytoskelet in een celvrij systeem om de mechanismen te ontleden die de septineassemblage regelen bij hoge ruimtelijke en temporele resoluties. De kernstappen van septineassemblage omvatten septine heterooligomeer associatie en dissociatie met het membraan, polymerisatie in filamenten en de vorming van hogere orde structuren door interacties tussen filamenten. Hier presenteren we drie methoden om septineassemblage in verschillende contexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen. Deze methoden kunnen worden gebruikt om de biofysische parameters van septines in verschillende stadia van assemblage te bepalen: als enkele octameren die het membraan binden, als filamenten en als assemblages van filamenten. We gebruiken deze parameters in combinatie met metingen van krommingsbemonstering en preferentiële adsorptie om te begrijpen hoe krommingsdetectie werkt op verschillende lengte- en tijdschalen.

Na de bereiding van elke SLB kunnen septines of het eiwit van belang worden geïncubeerd met de gewenste ondersteuning en in beeld worden gebracht via TIRFM, confocale microscopie of SEM. De hier getoonde resultaten gebruiken septines die recombinant tot expressie zijn gebracht en gezuiverd van E. coli17. Met behulp van TIRFM op vlakke SLB's is het mogelijk om de lengte van filamenten en hun flexibiliteit te bepalen, de diffusiecoëfficiënten te meten en de assemblage in de loop van de t...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions at JoVE.com

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Dit protocol zal degenen die werken aan membraanbindende eiwitten begeleiden om te bepalen hoe membraanvorm een rol speelt bij de organisatie van eiwitassemblages. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de veelzijdigheid voor eiwittype, membraansamenstelling en membraangeometrie. Het maakt ook ondervraging mogelijk van hoe een lipide bilayer de eigenschappen van geassocieerde eiwitten kan veranderen.Om een goed membraan voor het experiment te identificeren, stellen we voor een checklist op te stellen die lipidendiffusiesnelheden, mobiliteit van het eiwit van belang en of er ontlast liposomen of gefuseerde liposomen aan het oppervlak zijn geplakt, kan omvatten. Om te beginnen met het plasma reinigen van de dia's, reinigt u de plasmareiniger gedurende vijf minuten met zuurstof om lucht uit de leidingen en kamer te verwijderen. Schik droge glasglijbanen in een keramische wieg.Laat tijdens het purgeren een inert gas over de glazen schuifjes van de microdeksel stromen om stof en deeltjes te verwijderen. Plaats de houder aan de achterkant van de plasmakamer, zodat de coverslips evenwijdig zijn aan de lange rand van de kamer. Laat de plasmareiniger 15 minuten met zuurstof op maximaal vermogen draaien.Snijd voor kamervoorbereiding de dop net onder het matte deel van een 0,2 milliliter PCR-buis af. Verf de rand van de PCR-buis met UV-geactiveerde lijm en vermijd de binnenkant van de buis. Plaats de PCR-buislijm voorzichtig in het midden van een plasma gereinigde coverslip en plaats de kamer vervolgens vijf tot zeven minuten onder UV-licht met een lange golflengte om de lijm uit te harden.Om een dubbellaag te vormen, voegt u de reagentia toe aan de put. Schud de kamers voorzichtig van links naar rechts om de SUV's te verstoren en incubeer vervolgens gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Spoel na incubatie de bilayer zes keer met 150 microliter SLBB door te pipetteren om overtollige lipiden weg te spoelen en was vervolgens de bilayer zes keer met 150 microliter reactiebuffer voordat u broedt met de septines.Verwijder bij de laatste wasstap de reactiebuffer en laat 75 microliter in de put achter. Voeg 25 microliter septines verdund in SSB en afbeelding toe door TIRF-microscopie. Vortex eerst de fles met silicamicrosferen gedurende 15 seconden, dan bad soniceren gedurende één minuut en vortex opnieuw gedurende 15 seconden om eventuele clusters te breken.Meng de kralen met SLBB en 10 microliter van vijf millimolaire SUV's in een microcentrifugebuis met lage adhesie. Incubeer het parellipidenmengsel gedurende een uur bij kamertemperatuur op een shaker om sedimentatie te voorkomen. Ontdooi ondertussen een gepegyleerde coverslip en lijm er een gesneden PCR-buis van 0,2 milliliter op.Na incubatie centrifugeer je de kralen gedurende 30 seconden op de aangewezen RCF. Verwijder na de eerste spin 50 microliter supernatant, voeg vervolgens 200 microliter PRB toe en meng door krachtig pipetteren. Verwijder voor de volgende rondes 200 microliter PRB en voeg nog eens 200 microliter toe na de tweede en derde spin en voeg 220 microliter PRB toe na de vierde spin.Als u een wedstrijdtest uitvoert met meerdere kraalgroottes, bereidt u de reactie voor door gelijke volumes van elke kraalgrootte te mengen en 29 microliter van dit kraalmengsel te verdunnen met 721 microliter reactiebuffer, voeg dan 75 microliter verdunde kralen en 25 microliter van het eiwit verdund in SSB toe aan de putten en meng. Als septines in een steady state worden gemeten, incubeer het mengsel dan gedurende één uur bij kamertemperatuur en beeld vervolgens af door middel van TIRF of confocale microscopie. TIRF-micrografieën van planaire SLB's geïncubeerd met septines in het groen toonden een homogene eiwitverdeling.SLB's gemaakt met slecht gereinigde glazen afdekplaten vertoonden gaten of openingen in de dubbellaag in regio's met een laag septine. Ontblote en tubulated liposomen kunnen zich ophopen op het oppervlak als oude liposomen worden gebruikt of als wasbeurten niet streng zijn. In micrografieën van lipide-gecoate microsferen gevisualiseerd met rhodamine toonde PE een gladde dubbellaagse afzetting.De bolvormige steunen waren gelijkmatig bedekt door het membraan en er waren weinig kralenclusters. Onvoldoende wassen van overtollige lipiden veroorzaakte ongelijke membraancoating zoals waargenomen door lipideklonten en onjuiste hantering veroorzaakte gaten in de bilayer. Onvoldoende mengen van kralen veroorzaakte klontering wat niet ideaal is voor het meten van de totale eiwitopname.Met behulp van de ondersteunde lipide bilayers die hier worden gepresenteerd, kunnen andere methoden zoals fluorescentie lifetime imaging microscopie, massacytometrie van membranen en high-speed atomaire krachtmicroscopie worden uitgevoerd om verschillende eiwit-eiwit- of eiwitmembraandynamica te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolatie van intermediaire filamentproteïnen uit meerdere muisweefsels om te bestuderen veroudering-geassocieerde post-translationele modificaties

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Een planaire beweeglijkheidstest om de biomodulating eigenschappen van natuurlijke producten te meten

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Co-translationele insertie van membraaneiwitten in voorgevormde nanodiscs

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Zuivering en kwaliteitscontrole van recombinante septinecomplexen voor celvrije reconstitutie

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...