Name: reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00
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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) Grant no. R01 GM-130934 et National Science Foundation (NSF) Grant MCB-2016022. B.N.C, E.J.D.V. et K.S.C. ont été soutenus en partie par une subvention de l’Institut national des sciences médicales générales sous le prix T32 GM119999.

REMARQUE: La formation de bicouches lipidiques supportées nécessite la préparation de petites vésicules unilamellaires monodispersées (VUS). Veuillez vous référer à un protocole24 publié précédemment sur la formation de SUV. En bref, tous les VUS sont formés par sonication par sonde pendant 12 min au total à 70% d’amplitude via des périodes de sonication de 4 min suivies de périodes de repos de 2 min dans l’eau glacée. Les solutions SUV doivent être bien clarifiées et monodis...

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	<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature.">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li><li>Parthasarathy, R., Groves, J. 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F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ArfGAP1+responds+to+membrane+curvature+through+the+folding+of+a+lipid+packing+sensor+motif.">ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif.</a> The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li><li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton.">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).</li><li>Picard, F., Paquet, M. -. J., Dufourc, &. #. 2. 0. 1. ;. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+geometry-driven+localization+of+a+small+protein.">Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).</li><li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix.">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li><li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes.">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li><li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size.">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).</li><li>Ferhan, A. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography.">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li><li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes.">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li><li>Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. 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A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers.">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li><li>Hupfeld, S., Hols&#230;ter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+size+analysis+by+dynamic/static+light+scattering+upon+size+exclusion-/field+flow-fractionation.">Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).</li><li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies.">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li><li>Woods, B. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism.">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments.">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).</li><li>Reimhult, E., H&#246;&#246;k, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution:+Influence+of+surface+chemistry,+vesicle+size,+temperature,+and+osmotic+pressure.">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li><li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li><li>Chan, Y. -. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li></ol>

Les membranes cellulaires prennent de nombreuses formes, courbures et propriétés physico-chimiques différentes. Afin d’étudier la machinerie à l’échelle nanométrique à travers laquelle les cellules construisent des assemblages à l’échelle micrométrique, il est nécessaire de concevoir des systèmes de reconstitution minimaux de mimétiques membranaires. Ce protocole présente des techniques qui contrôlent avec précision à la fois la courbure et la composition de la membrane tout en permettant à l’u...

Les formes des cellules et beaucoup de leurs compartiments internes dépendent des membranes lipidiques qui les entourent. Les membranes sont des structures viscoélastiques qui peuvent être déformées par des interactions avec les protéines, le tri des lipides et l’action des forces internes et externes pour générer une variété de formes 1,2,3,4. Ces formes sont souvent décrites en termes de courbure de la membrane. Les cellules utilisent une suite diversifiée de protéines capables de s’assembler préférentiellement sur des courbures membranaires particulières ou de les « détecter » pour assurer un contrôle spatio-temporel défini sur des processus tels que le trafic cellulaire, la cytocinèse et la migration 5,6. La dynamique de la machinerie cellulaire au niveau de la membrane est particulièrement difficile à observer en raison de la difficulté d’équilibrer le temps et la résolution spatiale avec la santé cellulaire. Bien que les techniques de super-résolution puissent offrir une vue détaillée de ces structures, elles nécessitent de longues acquisitions qui ne se prêtent pas aux délais d’assemblage / démontage pour la plupart des machines. De plus, la complexité moléculaire de ces assemblages dans leur environnement natif et la multitude de rôles qu’un seul composant peut jouer font des systèmes de reconstitution minimaux un outil précieux pour étudier la capacité fonctionnelle des molécules.
Des mimétiques membranaires minimaux ont été développés pour étudier les propriétés membranaires et les interactions protéine-membrane à l’extérieur de la cellule. Les mimétiques membranaires varient des bicouches lipidiques autoportantes, telles que les liposomes ou les vésicules unilamellaires géantes, aux bicouches lipidiques supportées (SLB)7,8,9,10. Les SLB sont des membranes biomimétiques ancrées au support sous-jacent, généralement composées de verre, de mica ou de silice11,12. Une variété de géométries peut être utilisée, y compris des surfaces planes, des sphères, des bâtonnets et même des substrats ondulés ou micromotifs pour sonder les interactions protéine-membrane sur des courbures concaves et convexes simultanément1 3,14,15,16,17,18 . La formation de bicouches commence par l’adsorption des vésicules sur une surface hydrophile, suivie de la fusion et de la rupture pour former une bicouche continue (Figure 1)19. Les bicouches prises en charge se prêtent particulièrement à la lumière et à la microscopie électronique, offrant à la fois un meilleur temps et une meilleure résolution spatiale que ce qui est souvent réalisable dans les cellules. Les SLB incurvés offrent en particulier un moyen attrayant de sonder la sensibilité à la courbure des protéines en l’absence de déformation significative de la membrane, ce qui permet de distinguer la détection de courbure et l’induction de courbure, qui sont souvent impossibles à séparer dans les systèmes autonomes.
Les septines sont une classe de protéines cytosquelettiques formant des filaments bien connues pour leur capacité à s’assembler sur des membranes incurvées positivement 6,18,20. Au cours du cycle cellulaire de la levure, les septines s’assemblent en un anneau et doivent se réorganiser pour former les structures de sablier et de double anneau associées à l’émergence des bourgeons et à la cytokinèse, respectivement21. Bien que de beaux travaux aient été réalisés en utilisant la microscopie électronique à réplique de platine pour observer l’architecture des septines à différents stades du cycle cellulaire22, l’observation de l’assemblage des septines au fil du temps à l’aide de la microscopie optique dans la levure a rencontré une résolution spatiale limitée. Des travaux antérieurs sur les septines utilisant des monocouches lipidiques visualisées par microscopie électronique à transmission (TEM) ont permis de reconstituer plusieurs structures de septines intéressantes telles que des anneaux, des faisceaux et des gazes23. Cependant, les techniques EM sont également limitées dans leur résolution temporelle, contrairement à la microscopie à fluorescence. Afin de mieux résoudre les paramètres cinétiques du processus multi-échelle d’assemblage de septines, nous nous sommes tournés vers les mimétiques membranaires pris en charge, où l’on peut contrôler soigneusement la géométrie de la membrane, les conditions de l’échantillon et la modalité d’imagerie.
Les protocoles décrits ici utilisent des SLB planaires ou incurvés, des protéines purifiées et une combinaison de techniques de microscopie. La microscopie confocale quantitative à fluorescence et la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM) ont été utilisées pour mesurer à la fois la liaison des protéines en vrac sur diverses courbures membranaires, ainsi que pour mesurer la cinétique de liaison de molécules individuelles. De plus, ce protocole a été adapté pour être utilisé avec la microscopie électronique à balayage (MEB) pour examiner l’ultrastructure des protéines sur différentes courbures de membrane. Bien que ces protocoles se concentrent sur le cytosquelette septine, les protocoles peuvent être facilement modifiés pour étudier la sensibilité à la courbure de toute protéine que le lecteur trouve intéressante. En outre, ceux qui travaillent dans des domaines tels que l’endocytose ou le trafic vésiculeux peuvent trouver ces techniques utiles pour sonder les assemblages dépendants de la courbure des complexes multiprotéiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural</td>
			<td>Watson</td>
			<td>137-211C(EX)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL low adhesion tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1405-2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4612-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for making PEGylated coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152450</td>
			<td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Liss Rhodamine PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Sodium Cacodylate Buffer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-223EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose 4000cp</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M052-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microglass coverslips for planar bilayers</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td>22x22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Functionalized Silica Microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratories, Inc.</td>
			<td>Depends on size: SS0200*-SS0500*</td>
			<td>Silica in aqueous suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Thorlabs</td>
			<td>NOA 68</td>
			<td>Flexible adhesive for glass or plastics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20816-12-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-25</td>
			<td>Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0395-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverglass, #1.5 12mm&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1510R-MT</td>
			<td>Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy PI</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>Spectroline</td>
			<td>ENF-260C</td>
			<td>115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WhatmanGlass Microfiber Filter Paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28455-030</td>
			<td>42.5 mm diameter, Grade GF/C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of septin assembly at membranes to study biophysical properties and functions

La plupart des cellules peuvent sentir et changer leur forme pour effectuer des processus cellulaires fondamentaux. Chez de nombreux eucaryotes, le cytosquelette septine fait partie intégrante de la coordination des changements de forme tels que la cytocinèse, la croissance polarisée et la migration. Les septines sont des protéines formant des filaments qui s’assemblent pour former diverses structures d’ordre supérieur et, dans de nombreux cas, se trouvent dans différentes zones de la membrane plasmique, notamment dans les régions de courbure positive à l’échelle du micron. La surveillance du processus d’assemblage de la septine in vivo est entravée par les limites de la microscopie optique dans les cellules, ainsi que par la complexité des interactions avec les membranes et les éléments cytosquelettiques, ce qui rend difficile la quantification de la dynamique de la septine dans les systèmes vivants. Heureusement, il y a eu des progrès substantiels au cours de la dernière décennie dans la reconstitution du cytosquelette de septine dans un système sans cellule pour disséquer les mécanismes contrôlant l’assemblage de la septine à des résolutions spatiales et temporelles élevées. Les principales étapes de l’assemblage de la septine comprennent l’association et la dissociation de l’hétérooligomère de septine avec la membrane, la polymérisation en filaments et la formation de structures d’ordre supérieur par le biais d’interactions entre filaments. Ici, nous présentons trois méthodes pour observer l’assemblage de septine dans différents contextes: les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tige. Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les paramètres biophysiques des septines à différents stades d’assemblage: en tant qu’octamères simples liant la membrane, en tant que filaments et en tant qu’assemblages de filaments. Nous utilisons ces paramètres associés à des mesures d’échantillonnage de courbure et d’adsorption préférentielle pour comprendre comment la détection de courbure fonctionne à diverses échelles de longueur et de temps.

Après la préparation de chaque SLB, les septines ou la protéine d’intérêt peuvent être incubées avec le support souhaité et imagées via TIRFM, microscopie confocale ou SEM. Les résultats présentés ici utilisent des septines exprimées de manière recombinante et purifiées à partir d’E. coli17. En utilisant TIRFM sur des SLB planaires, il est possible de déterminer la longueur des filaments et leur flexibilité, de mesurer les coefficients de diffusion et d’observer l?...

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Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Ce protocole guidera ceux qui travaillent sur les protéines de liaison membranaire pour déterminer comment la forme de la membrane joue un rôle dans l’organisation des assemblages de protéines. Le principal avantage de cette technique est sa polyvalence pour le type de protéine, la composition de la membrane et la géométrie de la membrane. Il permet également d’interroger sur la façon dont une bicouche lipidique peut modifier les propriétés des protéines associées.Pour identifier une bonne membrane pour l’expérience, nous suggérons d’établir une liste de contrôle qui pourrait inclure les taux de diffusion des lipides, la mobilité de la protéine d’intérêt et s’il existe des liposomes non éclatés ou des liposomes fusionnés collés à la surface. Pour commencer le nettoyage plasma des lames, purgez le nettoyant plasma pendant cinq minutes avec de l’oxygène pour éliminer l’air des conduites et de la chambre. Disposez les glissières de verre à couvercle sec dans un berceau en céramique.Pendant la purge, faites couler un gaz inerte sur les lames de verre du micro-couvercle pour éliminer la poussière et les particules. Placez le berceau à l’arrière de la chambre à plasma de manière à ce que les lamelles de couverture soient parallèles au long bord de la chambre. Faites fonctionner le nettoyeur plasma pendant 15 minutes avec de l’oxygène à puissance maximale.Pour la préparation de la chambre, coupez le bouchon juste en dessous de la partie givrée d’un tube PCR de 0,2 millilitre. Peignez le bord du tube PCR avec un adhésif activé par UV en évitant l’intérieur du tube. Placez délicatement la colle du tube PCR au centre d’une lamelle de couverture nettoyée au plasma, puis placez la chambre sous une lumière UV à grande longueur d’onde pendant cinq à sept minutes pour durcir l’adhésif.Pour former une bicouche, ajoutez les réactifs au puits. Secouez doucement les chambres d’un côté à l’autre pour perturber les VUS, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, rincer la bicouche six fois avec 150 microlitres de SLBB par pipetage pour éliminer l’excès de lipides, puis laver la bicouche six fois avec 150 microlitres de tampon réactionnel avant d’incuber avec les septines.Lors de la dernière étape de lavage, retirez le tampon de réaction, en laissant 75 microlitres dans le puits. Ajouter 25 microlitres de septines diluées dans du SSB et l’image par microscopie TIRF. Tout d’abord, vortex la bouteille contenant des microsphères de silice pendant 15 secondes, puis bain soniqué pendant une minute et vortex à nouveau pendant 15 secondes pour briser les amas.Mélanger les billes avec SLBB et 10 microlitres de VUS à cinq millimolaires dans un tube microcentrifuge à faible adhérence. Incuber le mélange lipidique de billes pendant une heure à température ambiante sur un agitateur pour éviter la sédimentation. Pendant ce temps, décongelez une lamelle de couverture pégylée et collez-y un tube PCR coupé de 0,2 millilitre.Après l’incubation, centrifuger les billes pendant 30 secondes au RCF désigné. Après le premier essorage, retirer 50 microlitres de surnageant, puis ajouter 200 microlitres de PRB et mélanger par pipetage vigoureux. Pour les prochains tours, retirez 200 microlitres de PRB et ajoutez 200 microlitres supplémentaires après le deuxième et le troisième spin et ajoutez 220 microlitres de PRB après le quatrième spin.Si vous effectuez un essai de compétition avec plusieurs tailles de billes, préparez la réaction en mélangeant des volumes égaux de chaque taille de bille et en diluant 29 microlitres de ce mélange de billes avec 721 microlitres de tampon de réaction, puis ajoutez 75 microlitres de billes diluées et 25 microlitres de protéine diluée dans du BSR dans les puits et mélangez. Si vous mesurez des septines à l’état d’équilibre, incuber le mélange à température ambiante pendant une heure, puis imager par microscopie confocale ou près de la FRBR. Les micrographies TIRF de SLB planaires incubés avec des septines montrées en vert ont montré une distribution homogène des protéines.Les SLB fabriqués avec des lamelles de verre mal nettoyées présentaient des trous ou des trous dans la bicouche dans les régions de faible septine. Les liposomes non éclatés et tubulés peuvent s’accumuler à la surface si de vieux liposomes sont utilisés ou si les lavages ne sont pas stricts. Dans les micrographies de microsphères recouvertes de lipides, visualisées à l’aide de rhodamine PE a montré un dépôt bicouche lisse.Les supports sphériques étaient uniformément recouverts par la membrane et il y avait peu de grappes de perles. Un lavage insuffisant de l’excès de lipides a entraîné un revêtement membranaire inégal observé par des amas lipidiques et une mauvaise manipulation a causé des lacunes dans la bicouche. Un mélange insuffisant des billes a provoqué une agglutination, ce qui n’est pas idéal pour mesurer l’absorption totale des protéines.En utilisant les bicouches lipidiques prises en charge présentées ici, d’autres méthodes telles que la microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence, la cytométrie de masse des membranes et la microscopie à force atomique à grande vitesse peuvent être effectuées pour examiner différentes dynamiques protéine-protéine ou protéine-membrane.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Recherche

Biochimie

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Échelle atomique des études structurales des assemblages macromoléculaires par spectroscopie RMN à l’état solide

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purification et Reconstitution de TRPV1 pour analyse spectroscopique

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Petits dosages colorimétriques de Lactate intracellulaire et Pyruvate chez le nématode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

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A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

Un test de motilité planaire pour évaluer les propriétés biomodulantes des produits naturels

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High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

La spectroscopie neutronique à haute résolution pour étudier la dynamique picoseconde-nanoseconde des protéines et de l’eau d’hydratation

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Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Purification et contrôle de qualité de complexes de septine recombinante pour reconstitution sans cellules

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