Name: lipid supplementation for longevity and gene transcriptional analysis in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-12-09T13:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Nous remercions P. Svay pour son soutien à la maintenance. Ce travail a été soutenu par les subventions NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) et NIH T32 ES027801 pré-doctorant étudiant boursier (MS). Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

La figure 1 illustre un schéma de l’alimentation lipidique en utilisant différents contextes expérimentaux.
1. Préparation de bactéries conditionnées par les lipides
<ol><li>Préparer la solution de base de restriction alimentaire à dilution bactérienne (RDB) en dissolvant 5,85 g de NaCl, 1,0 g deK2HPO4 et 6,0 g de KH2PO4 (voir le tableau des matières) dans 999 mL d’eau désionisée....

<ol>
	<li>Fahy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+LIPID+MAPS+comprehensive+classification+system+for+lipids+1.">Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1.</a> Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).</li><li>Liebisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+LIPID+MAPS+classification,+nomenclature,+and+shorthand+notation+for+MS-derived+lipid+structures.">Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures.</a> Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).</li><li>Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. 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La supplémentation en lipides a été utilisée dans la recherche sur le vieillissement pour élucider l’impact direct de certaines espèces lipidiques sur le vieillissement en bonne santé 6,7,23,26,27,31. Cependant, la procédure de supplémentation en lipides peut être difficile, et toute incohérence entre les expéri...

Lipide Les lipides sont de petites molécules hydrophobes ou amphipathiques solubles dans les solvants organiques mais insolubles dans l’eau 1,2. Les molécules lipidiques distinctes se différencient les unes des autres en fonction du nombre de carbones contenus dans leurs chaînes, de leur emplacement, du nombre de doubles liaisons et des structures liées, y compris le glycérol ou les phosphates. Les lipides jouent un rôle crucial à l’intérieur et entre les cellules distinctes pour réguler les fonctions de l’organisme, notamment en constituant des bicouches membranaires, en assurant le stockage de l’énergie et en agissant comme molécules de signalisation 3,4.
Premièrement, les lipides sont des composants structurels des membranes biologiques, y compris la membrane plasmique et les membranes subcellulaires intracellulaires qui séparent les compartiments internes de l’environnement extracellulaire. Deuxièmement, les lipides sont la principale forme de stockage d’énergie chez les animaux vertébrés et invertébrés. Les lipides neutres, y compris les triacylglycérols, sont stockés pendant une période prolongée dans divers tissus, y compris dans le tissu adipeux. Chez le nématode Caenorhabditis elegans, l’intestin est le principal organe métabolique de stockage des graisses; Sa fonction n’est pas seulement impliquée dans la digestion et l’absorption des nutriments, mais également dans le processus de désintoxication, qui ressemble à l’activité des hépatocytes de mammifères. D’autres tissus de stockage des graisses comprennent la lignée germinale, dans laquelle les lipides sont essentiels au développement des ovocytes, et l’hypoderme, qui est composé de cellules épidermiques semblables à la peau 3,5. Troisièmement, au cours des dernières années, de plus en plus de preuves ont suggéré que les lipides sont de puissantes molécules de signalisation impliquées dans la signalisation intra et extracellulaire en agissant directement sur une variété de récepteurs, y compris les récepteurs couplés aux protéines G et nucléaires, ou indirectement via la modulation de la fluidité membranaire ou les modifications post-traductionnelles 6,7,8,9 . D’autres études continueront d’élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents de la signalisation lipidique dans la promotion de la longévité et de la durée de vie.
Les organismes modèles sont importants pour répondre à des questions biologiques spécifiques qui sont trop complexes pour être étudiées chez l’homme. Par exemple, le ver rond C. elegans est un excellent modèle pour effectuer des analyses génétiques afin de disséquer les processus biologiques pertinents pour la nutrition humaine et les maladies10. Les voies moléculaires hautement conservées pertinentes pour la physiologie humaine, les tissus complexes, les modèles comportementaux et les nombreux outils de manipulation génétique font de C. elegans un organisme modèle remarquable11. Par exemple, C. elegans est excellent dans la transmission de criblages génétiques pour identifier des gènes spécifiques au phénotype, ainsi que dans les criblages génétiques inverses à l’échelle du génome via l’interférence ARN12.
En laboratoire, les nématodes sont cultivés sur des plaques de Petri ensemencées d’une pelouse de bactéries Escherichia coli, fournissant des macronutriments tels que des protéines, des glucides et des acides gras saturés et insaturés comme sources d’énergie et éléments constitutifs, et des micronutriments tels que des cofacteurs et des vitamines13. Comme les mammifères, les nématodes synthétisent des molécules d’acides gras à partir de l’acide palmitique et de l’acide stéarique (molécules saturées de 16 carbones et de 18 carbones, respectivement) qui sont désaturées séquentiellement et allongées en une variété d’acides gras mono-insaturés (AGMI) et d’acides gras polyinsaturés (AGPI)14,15,16,17,18. Fait intéressant, C. elegans est capable de synthétiser de novo tous les acides gras et enzymes de base nécessaires impliqués dans la biosynthèse, la désaturation et l’allongement des acides gras, facilitant ainsi la synthèse d’AGPI à longue chaîne19. Contrairement aux autres espèces animales, C. elegans peut convertir les acides gras ω-6 à 18 et 20 carbones en acides gras ω-3 avec ses propres enzymes ω-3 désaturase. De plus, les vers possèdent une désaturase Δ12 qui catalyse la formation d’acide linoléique (LA) à partir de l’acide oléique (OA, 18:1)20,21. La plupart des animaux ou des plantes manquent à la fois de désaturases Δ12 et ω-3 et dépendent donc de l’apport alimentaire de ω-6 et ω-3 pour obtenir leurs AGPI, alors que C. elegans n’a pas besoin d’acides gras alimentaires22. Des mutants isolés dépourvus d’enzymes désaturases fonctionnelles ont été utilisés pour étudier les fonctions d’acides gras spécifiques dans des processus biologiques distincts, y compris la reproduction, la croissance, la longévité et la neurotransmission. L’effet des acides gras individuels sur des voies biologiques spécifiques peut être abordé à l’aide d’une approche génétique et d’une supplémentation alimentaire16,17,23. À ce jour, la recherche sur les lipides s’est concentrée sur la caractérisation des gènes impliqués dans la synthèse, la dégradation, le stockage et la dégradation des lipides dans les affections neurologiques et développementales24. Cependant, les rôles des lipides dans la régulation de la longévité commencent tout juste à être révélés.
Signalisation lipidique dans la régulation de la longévité Les lipides jouent un rôle crucial dans la régulation de la longévité en activant des cascades de signalisation cellulaire dans des tissus et des types de cellules distincts. Des études récentes ont mis en évidence les rôles actifs des lipides dans la modulation de la transcription et de la communication cellule-cellule via des protéines liant les lipides ou la reconnaissance des récepteurs membranaires25. De plus, la supplémentation en lipides alimentaires offre un excellent outil pour disséquer comment le métabolisme des lipides influence la durée de vie chez C. elegans. Il a été démontré que des AGMI et des AGPI distincts favorisent la longévité en activant les facteurs de transcription26,27.
Les modèles de longévité, y compris la signalisation insuline/IGF-1 et l’ablation des cellules précurseurs de la lignée germinale, sont associés à la voie de biosynthèse des AGMI, et la supplémentation en AGMI, y compris l’acide oléique, l’acide palmitoléique et le cis-vaccenic, est suffisante pour prolonger la durée de vie de C. elegans 26. Bien que l’effet de longévité conféré par l’administration de MUFA nécessite une étude plus approfondie, le mécanisme sous-jacent est susceptible d’être médié par le facteur de transcription SKN-1 / Nrf2, qui est un activateur clé de la réponse au stress oxydatif et de la régulation de la longévité28,29. Parmi les AGMI, une classe particulière d’acyléthanolamides gras appelés N-acyléthanolamines (NAE) joue un rôle crucial dans des mécanismes distincts, notamment l’inflammation, les allergies, l’apprentissage, la mémoire et le métabolisme énergétique30. En particulier, la molécule lipidique connue sous le nom d’oléoyléthanolamide (OEA) a été identifiée comme un régulateur positif de la longévité en favorisant la translocation de la protéine de liaison aux lipides 8 (LBP-8) dans le noyau pour activer les récepteurs hormonaux nucléaires NHR-49 et NHR-807. La supplémentation de l’analogue de l’OEA KDS-5104 est suffisante pour prolonger la durée de vie, et induit l’expression de gènes impliqués dans les réponses au stress oxydatif et la β-oxydation mitochondriale 7,8.
Dans le même temps, le rôle des AGPI a également été lié à la réglementation de la longévité. L’administration d’acide gras α-linolénique (ALA) d’AGPI ω-3 favorise la longévité en activant les facteurs de transcription NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF et en induisant la β-oxydation mitochondriale31. Fait intéressant, les produits peroxydés d’ALA, appelés oxylipines, activent SKN-1 / NRF, ce qui suggère que les AGPI et leurs dérivés oxydatifs peuvent conférer des avantages de longévité23. La supplémentation en acide arachidonique (AA) et en acide dihomo-γ-linolénique (DGLA) d’acide gras ω-6 prolonge la durée de vie par activation de l’autophagie, favorisant le contrôle de la qualité des protéines et entraînant la dégradation des agrégats de protéines gaspillés et toxiques27,32. Plus récemment, une régulation de signalisation cellulaire non autonome médiée par la protéine de liaison aux lipides 3 (LBP-3) et la DGLA s’est avérée cruciale pour promouvoir la longévité en envoyant des signaux périphériques aux neurones, suggérant un rôle à long terme des molécules lipidiques dans la communication intertissulaire aux niveaux systémiques33. La présente étude rapporte chaque étape pour effectuer une supplémentation en lipides avec des bactéries ensemencées sur des plaques ou une suspension bactérienne en culture liquide. Ces méthodologies sont utilisées pour évaluer la durée de vie et l’analyse transcriptionnelle, en utilisant le contenu du corps entier ou des tissus disséqués dérivés de quelques vers. Les techniques suivantes peuvent être adaptées à une variété d’études nutritionnelles et offrent un outil valide pour disséquer comment le métabolisme des lipides influence la longévité et le vieillissement en santé.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Pestle</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>93-165P15</td>
			<td>For worm grinding with Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9639-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix</td>
			<td>GenDEPOT</td>
			<td>R5600</td>
			<td>For reverse transcription from bulk worm samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A28567</td>
			<td>For qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1248</td>
			<td>For spin down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8&#34; tip</td>
			<td>Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td>100-132-888R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8503-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444R</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf vapo protect mastercycler pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>665180</td>
			<td>12-well plates for licuid feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>664161</td>
			<td>For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>628161</td>
			<td>For worm6-cm NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PX1835-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SPCML1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipl-4Tg</td>
			<td>MCW Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transgenic C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipl-4Tg;fat-3(wa22)</td>
			<td>MCW Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transgenic C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4483354</td>
			<td>96-well qPCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied BioSystem</td>
			<td>4311971</td>
			<td>For sealing the 96-well qPCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10 Water Purification System</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z00Q0V0WW</td>
			<td>Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>C. elegans wild isolate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For measuring RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bacteria used as C. elegans food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4&#183;3H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green cells-to-Ct kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4402953</td>
			<td>For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4367659</td>
			<td>For qPCR from bulk worm samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright germicidal ultra bleach&#160;</td>
			<td>KIK International LLC.</td>
			<td>59647210143</td>
			<td>6% house bleach For worm egg preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td>Watch glass for dissecting the worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7500-4337</td>
			<td>For bacteria collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall ST 8 centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7500-7200</td>
			<td>For worm egg preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>TheroFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNA-free kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>For removing DNA contamination in RNA extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer 59</td>
			<td>Denville Scientific INV</td>
			<td>S7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>For worm grinding with Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm picker</td>
			<td>WormStuff</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid supplementation for longevity and gene transcriptional analysis in caenorhabditis elegans

Le vieillissement est un processus complexe caractérisé par des changements physiologiques progressifs résultant à la fois de contributions environnementales et génétiques. Les lipides sont essentiels pour constituer les composants structurels des membranes cellulaires, stocker l’énergie et en tant que molécules de signalisation. La régulation du métabolisme et de la signalisation des lipides est essentielle pour activer des voies de longévité distinctes. Le ver rond Caenorhabditis elegans est un organisme excellent et puissant pour disséquer la contribution du métabolisme lipidique et de la signalisation dans la régulation de la longévité. De nombreuses études ont décrit comment la supplémentation alimentaire de molécules lipidiques spécifiques peut prolonger la durée de vie de C. elegans ; Cependant, des différences mineures dans les conditions de supplémentation peuvent causer des problèmes de reproductibilité entre les scientifiques de différents laboratoires. Ici, deux méthodes de supplémentation détaillées pour C. elegans sont signalées en utilisant la supplémentation lipidique soit avec des bactéries ensemencées sur des plaques, soit une suspension bactérienne en culture liquide. Vous trouverez également ici les détails permettant d’effectuer des tests de durée de vie avec supplémentation en lipides à vie et une analyse qRT-PCR à l’aide d’un lysat de ver entier ou de tissus disséqués dérivés de quelques vers. En utilisant une combinaison d’études longitudinales et d’enquêtes transcriptionnelles sur la supplémentation en lipides, les tests d’alimentation fournissent des approches fiables pour disséquer comment les lipides influencent la longévité et le vieillissement en bonne santé. Cette méthodologie peut également être adaptée à diverses approches de dépistage nutritionnel afin d’évaluer les changements dans un sous-ensemble de transcrits en utilisant soit un petit nombre de tissus disséqués, soit quelques animaux.

Validation des changements transcriptionnels à l’aide de quelques vers entiers lors de la supplémentation en lipides Pour déterminer si le protocole d’extraction et de rétrotranscription de l’ARN en ADNc de quelques vers entiers est reproductible et comparable aux données des vers en vrac, une souche de ver à longue durée de vie surexprimant la lipase lysosomale lipase lipl-4 dans l’intestin a été utilisée 7,8,33,35....

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Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

Le présent protocole décrit des méthodes de supplémentation en lipides dans des cultures liquides et sur plaque pour Caenorhabditis elegans, associées à des études longitudinales et à l’analyse transcriptionnelle des gènes à partir de vers et de tissus de vers en vrac ou de quelques vers.

Supplémentation en lipides pour la longévité et analyse transcriptionnelle des gènes chez Caenorhabditis elegans

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

Ce protocole décrit deux stratégies de supplémentation en lipides avec une combinaison d’analyses longitudinales et transcriptionnelles dans l’organisme modèle, C. elegans. La technique décrit comment examiner les changements transcriptionnels en utilisant quelques vers ou tissus de vers disséqués et comment l’alimentation liquide d’une population d’insectes pourrait être couplée à des techniques hydroélectriques. Les personnes qui effectuent cette technique doivent pratiquer la dissection tissulaire en raison de la courte fenêtre de temps pour effectuer l’expérience afin d’obtenir une analyse transcriptionnelle adéquate.Pour commencer, prélevez les bactéries OP50 en centrifugeant la culture cultivée pendant la nuit à 4 000 g pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant. Suspendre la pastille bactérienne dans 20 millilitres de dilution bactérienne, de restriction alimentaire ou de base BDR par vortex et répéter la centrifugation pendant 10 minutes.Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille bactérienne dans le milieu BDR pour préparer un stock bactérien BDR 20 X. Diluer le stock de bactéries à 5X à l’aide d’un milieu BDR avant utilisation. En utilisant de l’éthanol ou du diméthylsulfoxyde comme solvant, préparer une solution mère de lipides dans un nouveau flacon en verre autoclavé et remplir le flacon en verre avec de l’argon ou de l’azote pour éviter l’oxydation.Transférer la solution mère lipidique dans la solution bactérienne BDR pour obtenir la concentration finale souhaitée dans les conditions d’alimentation. Bien mélanger en tourbillonnant pendant 20 secondes. Préparer le véhicule contrôlé en mélangeant les mêmes volumes d’éthanol filtré ou de diméthylsulfoxyde avec des bactéries BDR.Effectuer la supplémentation lipidique et la culture liquide en transférant la quantité désirée de lipides ou de contrôle du véhicule à chaque puits d’une plaque de 12 puits avec trois à quatre répétitions pour chaque condition d’alimentation. Mélanger la suspension synchronisée de vers Caenorrhabditis elegans avec 5X bactéries BDR dans un rapport de un à un pour obtenir une concentration finale de 1 500 vers par millilitre et 2,5X pour les bactéries. Ensuite, transférez deux millilitres du mélange de bactéries de vers dans chaque puits de la plaque de 12 puits.Lorsque vous avez terminé, enveloppez la plaque de 12 puits avec du papier d’aluminium et agitez la plaque dans un incubateur à 20 degrés Celsius à 100 tr / min pour la durée d’incubation souhaitée. Pour la supplémentation en lipides sur plaques, ensemencez un millilitre de bactéries conditionnées par les lipides au centre d’un milieu de croissance de nématodes de 10 centimètres ou d’une plaque de gélose NGM. Assurez-vous que la solution de travail finale est vortex plusieurs fois entre l’ensemencement des deux plaques lorsque vous travaillez avec un grand nombre de plaques.Sécher l’assiette dans l’obscurité à l’intérieur d’une hotte de biosécurité. Transférer 3000 vers de la culture de vers synchronisée vers la plaque de 10 centimètres. Sécher la plaque dans une hotte de biosécurité jusqu’à ce que les vers qui nageaient sur les plaques supplémentées en lipides commencent à ramper.Une fois séchée, incuber la plaque conditionnée en lipides dans un incubateur à 20 degrés Celsius pendant la durée souhaitée et, si vous utilisez des lipides polyinsaturés, protégez la plaque de la lumière. Préparer 20 microlitres de solution de lyse finale pour chaque échantillon en mélangeant 0,2 microlitre de DNase I avec 19,8 microlitres de solution de lyse dans un tube de PCR et bien mélanger en pipetant de haut en bas cinq fois. Pour extraire l’ARN du petit nombre de vers entiers, éliminez les bactéries en transférant 15 à 20 vers de la pelouse bactérienne vers une plaque NGM fraîchement non ensemencée.Transférer 15 à 20 vers de la plaque NGM non ensemencée vers le tube PCR contenant 20 microlitres de la solution de lyse finale fraîchement préparée avec le nombre minimum de bactéries et incuber la réaction de lyse pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois l’incubation terminée, conservez l’échantillon dans un bon bain d’eau froide et sondez les vers quatre fois, cinq secondes à chaque fois avec une amplitude de 30% et une impulsion pendant 15 secondes entre chaque moment de sonication. Incuber le tube à température ambiante pendant cinq minutes avant d’ajouter deux microlitres de solution stop dans la réaction de lyse et mélangez-le en tapotant doucement.Incuber la réaction pendant deux minutes à température ambiante, puis mettre le tube sur de la glace. Pour extraire l’ARN du tissu du ver, choisissez environ 20 vers de la pelouse bactérienne et placez-les dans une plaque NGM fraîche non ensemencée pour éliminer les bactéries des vers. Transférez 20 vers avec le moins de bactéries possible dans un verre de montre contenant 500 microlitres de solution M9 contenant quatre lévamisoles micromolaires.Lorsque les vers sont immobilisés, disséquez la lignée germinale ou l’intestin à l’aide d’une aiguille de calibre 25 qui peut être attachée à la seringue d’un millilitre. À l’aide d’une pipette en verre autoclavée, transférer les tissus disséqués dans le tube PCR et déposer le tube sur de la glace pendant deux minutes permettant le dépôt du matériau au fond. Retirez le surnageant du tube de PCR avant d’ajouter 20 microlitres de solution de lyse finale et mélangez-le bien en tapotant.Après avoir incubé la réaction de lyse pendant cinq minutes, ajoutez deux microlitres de solution d’arrêt et tapotez le tube plusieurs fois. Incuber le tube pendant deux minutes avant de procéder à la transcription inverse. Dans l’étude de validation, l’ARN extrait d’une grande population et quelques vers ont montré une induction similaire des gènes de traitement des neuropeptides, egl-3 et egl-21.Cela suggère que l’extraction de l’ARN de quelques vers peut être une alternative valable aux techniques standard de synthèse de l’ADNC à partir de grandes populations. Dans l’intestin disséqué des vers transgéniques lipl-4, complétés par de l’acide dihomo-gamma-linolénique, ou DGLA, les gènes de traitement neuropeptidique neuronal n’ont pas été induits. La supplémentation en DGLA à différentes concentrations a sauvé l’extension de la durée de vie chez les vers lors de l’élimination de la graisse 3.Les vers avec supplémentation en lipides peuvent également être traités pour le séquençage de l’ARN, la protéomique, la métabolomique et les études comportementales pour identifier des phénotypes supplémentaires dans ces conditions spécifiques. Cette méthodologie peut être appliquée à la recherche sur le vieillissement, à la biologie des lipides et à tout autre domaine de recherche visant à établir une relation entre un certain phénotype et un facteur nutritionnel ou un métabolite.

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

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