Name: lipid supplementation for longevity and gene transcriptional analysis in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-12-09T13:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Wir danken P. Svay für die Unterstützung bei der Wartung. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI Investigator (M.C.W.) und NIH T32 ES027801 Pre-doctoral Student Fellow (M.S.) unterstützt. Einige Stämme wurden vom CGC bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Lipidfütterung unter Verwendung verschiedener experimenteller Einstellungen.
1. Herstellung von lipidkonditionierten Bakterien
<ol><li>Die BDR-Basislösung (Bacterial dilution dietary restriction aires) wird hergestellt, indem 5,85 g NaCl, 1,0 g K2HPO4 und 6,0 gKH2PO4(siehe Materialtabelle) in 999 ml entionisiertem Wasser gelöst werden.</...

<ol>
	<li>Fahy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+LIPID+MAPS+comprehensive+classification+system+for+lipids+1.">Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1.</a> Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).</li><li>Liebisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+LIPID+MAPS+classification,+nomenclature,+and+shorthand+notation+for+MS-derived+lipid+structures.">Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures.</a> Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).</li><li>Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. 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Lipidergänzung wurde in der Alterungsforschung eingesetzt, um die direkten Auswirkungen bestimmter Lipidspezies auf gesundes Altern aufzuklären 6,7,23,26,27,31. Das Lipidergänzungsverfahren kann jedoch eine Herausforderung darstellen, und jede Inkonsistenz zwischen Experimenten kann zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen f?...

Lipide Lipide sind kleine hydrophobe oder amphipathische Moleküle, die in organischen Lösungsmitteln löslich, aber in Wasser unlöslichsind 1,2. Unterschiedliche Lipidmoleküle unterscheiden sich voneinander basierend auf der Anzahl der in ihren Ketten enthaltenen Kohlenstoffe, der Lage, der Anzahl der Doppelbindungen und der gebundenen Strukturen, einschließlich Glycerin oder Phosphaten. Lipide spielen eine entscheidende Rolle innerhalb und zwischen verschiedenen Zellen, um organismische Funktionen zu regulieren, einschließlich der Bildung von Membrandoppelschichten, der Bereitstellung von Energiespeicherung und der Funktion als Signalmoleküle 3,4.
Erstens sind Lipide strukturelle Bestandteile biologischer Membranen, einschließlich der Plasmamembran und intrazellulärer subzellulärer Membranen, die die inneren Kompartimente von der extrazellulären Umgebung trennen. Zweitens sind Lipide die wichtigste Form der Energiespeicherung bei Wirbeltieren und wirbellosen Tieren. Neutrale Lipide, einschließlich Triacylglycerine, werden über einen längeren Zeitraum in verschiedenen Geweben, einschließlich im Fettgewebe, gespeichert. Beim Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist der Darm das wichtigste metabolische Fettspeicherorgan; Seine Funktion ist nicht nur an der Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen beteiligt, sondern auch am Entgiftungsprozess, der der Aktivität von Säugetierhepatozyten ähnelt. Andere Fettspeichergewebe umfassen die Keimbahn, in der Lipide für die Entwicklung von Eizellen unerlässlich sind, und die Hypodermis, die aus hautähnlichen epidermalen Zellen besteht 3,5. Drittens haben in den letzten Jahren mehr Beweise dafür gezeigt, dass Lipide starke Signalmoleküle sind, die an der intra- und extrazellulären Signalübertragung beteiligt sind, indem sie direkt auf eine Vielzahl von Rezeptoren wirken, einschließlich G-Protein-gekoppelter und nukleärer Rezeptoren, oder indirekt über Membranfluiditätsmodulation oder posttranslationale Modifikationen 6,7,8,9 . Weitere Studien werden weiterhin die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Lipidsignalisierung zur Förderung von Langlebigkeit und Gesundheitsspanne aufklären.
Modellorganismen sind wichtig, um spezifische biologische Fragen zu beantworten, die zu komplex sind, um sie am Menschen zu untersuchen. Zum Beispiel ist der Spulwurm C. elegans ein hervorragendes Modell für die Durchführung genetischer Analysen zur Analyse biologischer Prozesse, die für die menschliche Ernährung und Krankheit relevant sind10. Die hochkonservierten molekularen Signalwege, die für die menschliche Physiologie relevant sind, komplexe Gewebe, Verhaltensmuster und reichlich genetische Manipulationswerkzeuge machen C. elegans zu einem bemerkenswerten Modellorganismus11. Zum Beispiel eignet sich C. elegans hervorragend für die Weiterleitung genetischer Screens zur Identifizierung phänotypspezifischer Gene sowie für genomweite umgekehrte genetische Screens über RNA-Interferenz12.
In Laboratorien werden die Nematoden auf Agar-Petriplatten gezüchtet, die mit einem Rasen aus Escherichia coli-Bakterien besät sind und Makronährstoffe wie Proteine, Kohlenhydrate sowie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren als Energiequellen und Bausteine sowie Mikronährstoffe wie Co-Faktoren und Vitamine13 liefern. Ähnlich wie Säugetiere synthetisieren Nematoden Fettsäuremoleküle sowohl aus Palmitinsäure als auch aus Stearinsäure (gesättigte 16-Kohlenstoff- bzw. 18-Kohlenstoffmoleküle), die sequentiell entsättigt und zu einer Vielzahl von einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFAs) und mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) verlängert werden14,15,16,17,18. Interessanterweise ist C. elegans in der Lage, alle erforderlichen Fettsäuren und Kernenzyme de novo zu synthetisieren, die an der Fettsäurebiosynthese, -entsättigung und -verlängerung beteiligt sind, was die Synthese langkettiger PUFAs erleichtert19. Im Gegensatz zu anderen Tierarten kann C. elegans 18-Kohlenstoff- und 20-Kohlenstoff-ω-6-Fettsäuren mit eigenen ω-3-Desaturase-Enzymen in ω-3-Fettsäuren umwandeln. Zusätzlich besitzen Würmer eine Δ12-Desaturase, die die Bildung von Linolsäure (LA) aus Ölsäure katalysiert (OA, 18:1)20,21. Den meisten Tieren oder Pflanzen fehlen sowohl Δ12- als auch ω-3-Desaturasen und sind daher auf die Nahrungsaufnahme von ω-6 und ω-3 angewiesen, um ihre PUFAs zu erhalten, während C. elegans keine Nahrungsfettsäuren benötigt22. Isolierte Mutanten ohne funktionelle Desaturase-Enzyme wurden verwendet, um die Funktionen spezifischer Fettsäuren in verschiedenen biologischen Prozessen zu untersuchen, einschließlich Fortpflanzung, Wachstum, Langlebigkeit und Neurotransmission. Die Wirkung einzelner Fettsäuren auf spezifische biologische Signalwege kann sowohl durch einen genetischen Ansatz als auch durch Nahrungsergänzung behandelt werden16,17,23. Bisher konzentrierte sich die Lipidforschung auf die Charakterisierung von Genen, die an der Synthese, dem Abbau, der Speicherung und dem Abbau von Lipiden bei neurologischen und Entwicklungsbedingungen beteiligt sind24. Die Rolle von Lipiden bei der Langlebigkeitsregulation beginnt jedoch gerade erst, aufgedeckt zu werden.
Lipidsignalisierung in der Langlebigkeitsregulation Lipide spielen eine entscheidende Rolle bei der Langlebigkeitsregulation, indem sie zelluläre Signalkaskaden in verschiedenen Geweben und Zelltypen aktivieren. Neuere Studien haben die aktive Rolle von Lipiden bei der Modulation der Transkription und Zell-Zell-Kommunikation über lipidbindende Proteine oder die Erkennung von Membranrezeptoren hervorgehoben25. Darüber hinaus bietet die Nahrungsergänzung mit Lipiden ein hervorragendes Werkzeug, um zu analysieren, wie der Fettstoffwechsel die Lebensdauer von C. elegans beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass unterschiedliche MUFAs und PUFAs die Langlebigkeit fördern, indem sie die Transkriptionsfaktoren26,27 aktivieren.
Langlebigkeitsmodelle, einschließlich der Insulin / IGF-1-Signalisierung und der Ablation von Keimbahnvorläuferzellen, sind mit dem MUFA-Biosyntheseweg assoziiert, und eine MUFA-Supplementierung, einschließlich Ölsäure, Palmitoleinsäure und cis-Vaccen, reicht aus, um die Lebensdauer von C. elegans zu verlängern26. Obwohl der durch die MUFA-Verabreichung verliehene Langlebigkeitseffekt weitere Untersuchungen erfordert, wird der zugrunde liegende Mechanismus wahrscheinlich durch den SKN-1/Nrf2-Transkriptionsfaktor vermittelt, der ein Schlüsselaktivator der oxidativen Stressreaktion und der Langlebigkeitsregulationist 28,29. Unter MUFAs spielt eine bestimmte Klasse von Fettacylethanolamiden, die N-Acylethanolamine (NAEs), eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Mechanismen wie Entzündungen, Allergien, Lernen, Gedächtnis und Energiestoffwechsel30. Insbesondere wurde das als Oleoylethanolamid (OEA) bekannte Lipidmolekül als positiver Regulator der Langlebigkeit identifiziert, indem es die Translokation des lipidbindenden Proteins 8 (LBP-8) in den Zellkern fördert, um die nukleären Hormonrezeptoren NHR-49 und NHR-807 zu aktivieren. Die Supplementierung des OEA-Analogons KDS-5104 ist ausreichend, um die Lebensdauer zu verlängern, und induziert die Expression von Genen, die an oxidativen Stressreaktionen und mitochondrialer β-Oxidation beteiligt sind 7,8.
Gleichzeitig wurde die Rolle von PUFAs auch mit der Regulierung der Langlebigkeit in Verbindung gebracht. Die Verabreichung von PUFA ω-3-Fettsäuren α-Linolensäure (ALA) fördert die Langlebigkeit durch Aktivierung der NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF-Transkriptionsfaktoren und induziert mitochondriale β-Oxidation31. Interessanterweise aktivieren peroxidierte Produkte von ALA, die als Oxylipine bezeichnet werden, SKN-1 / NRF, was darauf hindeutet, dass sowohl PUFAs als auch ihre oxidativen Derivate Langlebigkeitsvorteile verleihen können23. Die Supplementierung von ω-6-Fettsäure Arachidonsäure (AA) und Dihomo-γ-Linolensäure (DGLA) verlängert die Lebensdauer durch Autophagieaktivierung, fördert die Proteinqualitätskontrolle und führt zum Abbau von verschwendeten und toxischen Proteinaggregaten27,32. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass eine zellun-autonome Signalregulation, die durch das lipidbindende Protein 3 (LBP-3) und DGLA vermittelt wird, entscheidend für die Förderung der Langlebigkeit ist, indem periphere Signale an Neuronen gesendet werden, was auf eine weitreichende Rolle von Lipidmolekülen in der Kommunikation zwischen Geweben auf systemischer Ebene hindeutet33. Die vorliegende Studie berichtet über jeden Schritt, um eine Lipidsupplementierung mit Bakterien durchzuführen, die auf Platten oder Bakteriensuspension in flüssiger Kultur ausgesät werden. Diese Methoden werden verwendet, um die Lebensdauer und die Transkriptionsanalyse zu bewerten, wobei Ganzkörperinhalte oder seziertes Gewebe von einigen Würmern verwendet werden. Die folgenden Techniken können an eine Vielzahl von Ernährungsstudien angepasst werden und bieten ein gültiges Werkzeug, um zu analysieren, wie der Fettstoffwechsel die Langlebigkeit und das gesunde Altern beeinflusst.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Pestle</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>93-165P15</td>
			<td>For worm grinding with Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9639-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix</td>
			<td>GenDEPOT</td>
			<td>R5600</td>
			<td>For reverse transcription from bulk worm samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A28567</td>
			<td>For qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1248</td>
			<td>For spin down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8&#34; tip</td>
			<td>Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td>100-132-888R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8503-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444R</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf vapo protect mastercycler pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>665180</td>
			<td>12-well plates for licuid feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>664161</td>
			<td>For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>628161</td>
			<td>For worm6-cm NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PX1835-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SPCML1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipl-4Tg</td>
			<td>MCW Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transgenic C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipl-4Tg;fat-3(wa22)</td>
			<td>MCW Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transgenic C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4483354</td>
			<td>96-well qPCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied BioSystem</td>
			<td>4311971</td>
			<td>For sealing the 96-well qPCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10 Water Purification System</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z00Q0V0WW</td>
			<td>Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>C. elegans wild isolate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For measuring RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bacteria used as C. elegans food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4&#183;3H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green cells-to-Ct kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4402953</td>
			<td>For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4367659</td>
			<td>For qPCR from bulk worm samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright germicidal ultra bleach&#160;</td>
			<td>KIK International LLC.</td>
			<td>59647210143</td>
			<td>6% house bleach For worm egg preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td>Watch glass for dissecting the worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7500-4337</td>
			<td>For bacteria collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall ST 8 centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7500-7200</td>
			<td>For worm egg preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>TheroFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNA-free kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>For removing DNA contamination in RNA extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer 59</td>
			<td>Denville Scientific INV</td>
			<td>S7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>For worm grinding with Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm picker</td>
			<td>WormStuff</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid supplementation for longevity and gene transcriptional analysis in caenorhabditis elegans

Das Altern ist ein komplexer Prozess, der durch fortschreitende physiologische Veränderungen gekennzeichnet ist, die sowohl aus Umwelt- als auch aus genetischen Beiträgen resultieren. Lipide sind entscheidend für die Bildung struktureller Bestandteile von Zellmembranen, die Speicherung von Energie und als Signalmoleküle. Die Regulierung des Fettstoffwechsels und der Signalübertragung ist unerlässlich, um unterschiedliche Langlebigkeitswege zu aktivieren. Der Spulwurm Caenorhabditis elegans ist ein ausgezeichneter und leistungsfähiger Organismus, um den Beitrag des Fettstoffwechsels und der Signalübertragung zur Langlebigkeitsregulation zu analysieren. Mehrere Forschungsstudien haben beschrieben, wie die Nahrungsergänzung spezifischer Lipidmoleküle die Lebensdauer von C. elegans verlängern kann; Geringfügige Unterschiede in den Ergänzungsbedingungen können jedoch zu Reproduzierbarkeitsproblemen bei Wissenschaftlern in verschiedenen Labors führen. Hier werden zwei detaillierte Supplementierungsmethoden für C. elegans berichtet, die eine Lipidsupplementierung entweder mit Bakterien, die auf Platten ausgesät werden, oder mit Bakteriensuspension in flüssiger Kultur verwenden. Ebenfalls hierin enthalten sind die Details zur Durchführung von Lebensdauer-Assays mit lebenslanger Lipidsupplementierung und qRT-PCR-Analyse unter Verwendung eines ganzen Wurmlysats oder seziertem Gewebe, das von einigen Würmern stammt. Unter Verwendung einer Kombination aus Längsschnittstudien und transkriptionellen Untersuchungen zur Lipidsupplementierung liefern die Fütterungsassays zuverlässige Ansätze, um zu analysieren, wie Lipide die Langlebigkeit und das gesunde Altern beeinflussen. Diese Methodik kann auch für verschiedene Ernährungs-Screening-Ansätze angepasst werden, um Veränderungen in einer Teilmenge von Transkripten entweder mit einer kleinen Anzahl von sezierten Geweben oder einigen Tieren zu bewerten.

Validierung von Transkriptionsveränderungen mit einigen ganzen Würmern nach Lipidsupplementierung Um zu untersuchen, ob das Protokoll zur Extraktion und Retrotranskribierung von RNA in cDNA von einigen ganzen Würmern reproduzierbar und vergleichbar mit den Daten von Massenwürmern ist, wurde ein langlebiger Wurmstamm verwendet, der die lysosomale saure Lipase lipl-4 im Darm überexprimiert 7,8,33,35.</s...

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Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

Das vorliegende Protokoll beschreibt Lipidergänzungsmethoden in Flüssig- und On-Plate-Kulturen für Caenorhabditis elegans, gekoppelt mit Längsschnittstudien und Gentranskriptionsanalysen von Massen oder einigen wenigen Würmern und Wurmgeweben.

Lipidsupplementierung für Langlebigkeit und Gentranskriptionsanalyse bei Caenorhabditis elegans

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

Dieses Protokoll beschreibt zwei Lipidsupplementierungsstrategien mit einer Kombination aus longitudinaler und transkriptioneller Analyse im Modellorganismus C.elegans. Die Technik beschreibt, wie transkriptionelle Veränderungen mit wenigen Würmern oder seziertem Wurmgewebe untersucht werden können und wie die flüssige Fütterung für eine Insektenpopulation mit Hydrotechniken gekoppelt werden könnte. Personen, die diese Technik durchführen, müssen die Gewebedissektion aufgrund des kurzen Zeitfensters für die Durchführung des Experiments üben, um eine angemessene Transkriptionsanalyse zu erreichen.Sammeln Sie zunächst OP50-Bakterien, indem Sie die über Nacht gewachsene Kultur bei 4.000 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Bakterienpellet in 20 Milliliter Bakterienverdünnung, diätetischer Einschränkung oder BDR-Base durch Wirbeln und wiederholen Sie die Zentrifugation erneut für 10 Minuten.Nach dem Verwerfen des Überstands das Bakterienpellet im BDR-Medium erneut suspendieren, um einen 20 X BDR-Bakterienbestand herzustellen. Verdünnen Sie die Bakterienbrühe vor Gebrauch mit einem BDR-Medium auf 5X. Verwenden Sie Ethanol oder Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel, bereiten Sie eine Lipid-Stammlösung in einer neuen autoklavierten Glasdurchstechflasche vor und füllen Sie die Glasdurchstechflasche mit Argon oder Stickstoff, um eine Oxidation zu verhindern.Übertragen Sie die Lipidstammlösung in die BDR-Bakterienlösung, um die gewünschte Endkonzentration unter Fütterungsbedingungen zu erreichen. Mischen Sie es gründlich, indem Sie 20 Sekunden lang wirbeln. Bereiten Sie das Fahrzeug kontrolliert vor, indem Sie die gleichen Mengen gefilterten Ethanols oder Dimethylsulfoxids mit BDR-Bakterien mischen.Führen Sie eine Lipidergänzung und Flüssigkeitskultur durch, indem Sie die gewünschte Menge an Lipid oder Vehikelkontrolle auf jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit drei bis vier Replikaten für jede Fütterungsbedingung übertragen. Mischen Sie die synchronisierte Caenorrhabditis elegans-Wurmsuspension mit 5X BDR-Bakterien in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis, um eine Endkonzentration von 1.500 Würmern pro Milliliter und 2,5X für Bakterien zu erreichen. Dann werden zwei Milliliter der Wurmbakterienmischung in jede Vertiefung der 12-Well-Platte überführt.Wenn Sie fertig sind, wickeln Sie die 12-Well-Platte mit Folie ein und schütteln Sie die Platte in einem 20-Grad-Celsius-Inkubator bei 100 U/min für die gewünschte Inkubationslänge. Für die Lipidergänzung auf Platten säen Sie einen Milliliter der lipidkonditionierten Bakterien auf die Mitte eines 10 Zentimeter großen Nematoden-Wachstumsmediums oder einer NGM-Agarplatte. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Arbeitslösung mehrmals zwischen der Aussaat der beiden Platten gewirbelt wird, wenn Sie mit einer hohen Anzahl von Platten arbeiten.Trocknen Sie die Platte im Dunkeln in einer Biosicherheitshaube. 3000 Würmer aus der synchronisierten Wurmkultur auf die 10 Zentimeter große Platte übertragen. Trocknen Sie die Platte in einer Biosicherheitshaube, bis Würmer, die auf den lipidergänzten Platten schwimmen, anfangen zu kriechen.Nach dem Trocknen inkubieren Sie die lipidkonditionierte Platte in einem 20-Grad-Celsius-Inkubator für die gewünschte Zeit und schützen Sie die Platte bei Verwendung mehrfach ungesättigter Lipide vor Licht. Bereiten Sie 20 Mikroliter endgültige Lyselösung für jede Probe vor, indem Sie 0,2 Mikroliter DNase I mit 19,8 Mikrolitern Lyselösung in einem PCR-Röhrchen mischen und es gut mischen, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren. Um die RNA aus der kleinen Anzahl ganzer Würmer zu extrahieren, entfernen Sie die Bakterien, indem Sie 15 bis 20 Würmer vom Bakterienrasen auf eine frisch ungesäte NGM-Platte übertragen.15 bis 20 Würmer von der ungesäten NGM-Platte in das PCR-Röhrchen mit 20 Mikrolitern der frisch zubereiteten endgültigen Lyselösung mit der minimalen Anzahl von Bakterien überführen und die Lysereaktion fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sobald die Inkubation beendet ist, halten Sie die Probe in einem schönen kalten Wasserbad und sondieren Sie die Würmer viermal, jeweils fünf Sekunden mit 30% Amplitude und Puls für 15 Sekunden zwischen jedem Zeitpunkt der Beschallung. Das Röhrchen bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren, bevor zwei Mikroliter Stopplösung in die Lysereaktion gegeben und durch vorsichtiges Klopfen gemischt werden.Die Reaktion zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann das Röhrchen auf Eis legen. Um RNA aus dem Wurmgewebe zu extrahieren, pflücken Sie etwa 20 Würmer aus dem Bakterienrasen und legen Sie sie in eine frische, ungesäte NGM-Platte, um die Bakterien aus den Würmern zu entfernen. 20 Würmer mit möglichst wenigen Bakterien in ein Uhrenglas mit 500 Mikrolitern M9-Lösung mit vier mikromolaren Levamisolen überführen.Wenn die Würmer immobilisiert sind, sezieren Sie die Keimbahn oder den Darm mit einer 25-Gauge-Nadel, die an der Ein-Milliliter-Spritze befestigt werden kann. Übertragen Sie das präparierte Gewebe mit einer autoklavierten Glaspipette in das PCR-Röhrchen und legen Sie das Röhrchen zwei Minuten lang auf Eis ab, damit das Material am Boden abgelagert werden kann. Entfernen Sie den Überstand aus dem PCR-Röhrchen, bevor Sie 20 Mikroliter endgültige Lyselösung hinzufügen, und mischen Sie ihn gut durch Anklopfen.Nach fünfminütiger Inkubation der Lysereaktion fügen Sie zwei Mikroliter Stopplösung hinzu und klopfen mehrmals auf das Röhrchen. Inkubieren Sie das Röhrchen für zwei Minuten, bevor Sie mit der umgekehrten Transkription fortfahren. In der Validierungsstudie zeigte RNA, die aus einer großen Population und einigen Würmern extrahiert wurde, eine ähnliche Induktion der Neuropeptid-verarbeitenden Gene egl-3 und egl-21.Es deutet darauf hin, dass die RNA-Extraktion aus einigen wenigen Würmern eine gültige Alternative zu Standard-CDNA-Synthesetechniken aus großen Populationen sein kann. Im sezierten Darm der Lipl-4-Transgenwürmer, ergänzt mit Dihomo-Gamma-Linolensäure oder DGLA, wurden die neuronalen Neuropeptid-verarbeitenden Gene nicht induziert. DGLA-Supplementierung in verschiedenen Konzentrationen rettete die Verlängerung der Lebensdauer in den Würmern nach Fett-3-Knockdown.Würmer mit Lipidsupplementierung können auch für RNA-Sequenzierung, Proteomik, Metabolomik und Verhaltensstudien verarbeitet werden, um zusätzliche Phänotypen unter diesen spezifischen Bedingungen zu identifizieren. Diese Methodik kann auf die Alternsforschung, die Lipidbiologie und jedes andere Forschungsgebiet angewendet werden, das darauf abzielt, eine Beziehung zwischen einem bestimmten Phänotyp und einem Ernährungsfaktor oder Metaboliten herzustellen.

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Forschung

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

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Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

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Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

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Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modellierung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...