Name: lipid supplementation for longevity and gene transcriptional analysis in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2022-12-09T13:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agradecemos a P. Svay pelo suporte de manutenção. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), investigador do HHMI (M.C.W.) e NIH T32 ES027801 bolsista de pré-doutorado (MS). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa do NIH (P40 OD010440).

A Figura 1 mostra um esquema de alimentação lipídica utilizando diferentes cenários experimentais.
1. Preparação de bactérias condicionadas por lípidos
<ol><li>Preparar a solução de base de restrição alimentar por diluição bacteriana (BDR) dissolvendo 5,85 g de NaCl, 1,0 g de K 2HPO 4 e 6,0 g de KH2PO4 (ver Tabela de Materiais) em 999 mL de água deionizada. Ajuste o pH p...

<ol>
	<li>Fahy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+LIPID+MAPS+comprehensive+classification+system+for+lipids+1.">Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1.</a> Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).</li><li>Liebisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+LIPID+MAPS+classification,+nomenclature,+and+shorthand+notation+for+MS-derived+lipid+structures.">Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures.</a> Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).</li><li>Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. 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A suplementação lipídica tem sido empregada em pesquisas sobre envelhecimento para elucidar o impacto direto de determinadas espécies lipídicas no envelhecimento saudável 6,7,23,26,27,31. No entanto, o procedimento de suplementação lipídica pode ser desafiador, e qualquer inconsistência entre os experimentos pode ca...

Lípidos Os lipídios são pequenas moléculas hidrofóbicas ou anfipáticas solúveis em solventes orgânicos, mas insolúveis em água 1,2. Moléculas lipídicas distintas se diferenciam umas das outras com base no número de carbonos contidos em suas cadeias, localização, número de ligações duplas e estruturas ligadas, incluindo glicerol ou fosfatos. Os lipídios desempenham papéis cruciais dentro e através de células distintas para regular as funções do organismo, incluindo a constituição de bicamadas de membrana, fornecendo armazenamento de energia e atuando como moléculas sinalizadoras 3,4.
Primeiro, os lipídios são componentes estruturais das membranas biológicas, incluindo a membrana plasmática e as membranas subcelulares intracelulares que dividem os compartimentos internos do ambiente extracelular. Em segundo lugar, os lipídios são a principal forma de armazenamento de energia em animais vertebrados e invertebrados. Lipídios neutros, incluindo triacilgliceróis, são armazenados por um período prolongado em vários tecidos, inclusive no tecido adiposo. No nematoide Caenorhabditis elegans, o intestino é o principal órgão metabólico de armazenamento de gordura; sua função não está envolvida apenas na digestão e absorção de nutrientes, mas também no processo de desintoxicação, que se assemelha à atividade dos hepatócitos de mamíferos. Outros tecidos de armazenamento de gordura incluem a linha germinativa, na qual os lipídios são essenciais para o desenvolvimento de ovócitos, e a hipoderme, que é composta por células epidérmicas semelhantes à pele 3,5. Em terceiro lugar, nos últimos anos, mais evidências sugeriram que os lipídios são poderosas moléculas sinalizadoras envolvidas na sinalização intra e extracelular, agindo diretamente em uma variedade de receptores, incluindo receptores nucleares e acoplados à proteína G, ou indiretamente via modulação da fluidez da membrana ou modificações pós-translacionais 6,7,8,9 . Novos estudos continuarão a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes da sinalização lipídica na promoção da longevidade e da saúde.
Organismos modelo são importantes para abordar questões biológicas específicas que são muito complexas para serem estudadas em humanos. Por exemplo, a lombriga C. elegans é um excelente modelo para a realização de análises genéticas para dissecar processos biológicos relevantes para a nutrição humana e doenças10. As vias moleculares altamente conservadas relevantes para a fisiologia humana, tecidos complexos, padrões comportamentais e abundantes ferramentas de manipulação genética fazem de C. elegans um organismo modelo notável11. Por exemplo, C. elegans é excelente no encaminhamento de telas genéticas para identificar genes específicos do fenótipo, bem como em telas genéticas reversas em todo o genoma via interferência de RNA12.
Em laboratórios, os nematoides são cultivados em placas de Petri de ágar semeadas com um gramado da bactéria Escherichia coli, fornecendo macronutrientes como proteínas, carboidratos e ácidos graxos saturados e insaturados como fontes de energia e blocos de construção, e micronutrientes como cofatores e vitaminas13. Semelhante aos mamíferos, os nematoides sintetizam moléculas de ácidos graxos a partir do ácido palmítico e do ácido esteárico (moléculas saturadas de 16 carbonos e 18 carbonos, respectivamente) que são sequencialmente dessaturadas e alongadas para uma variedade de ácidos graxos monoinsaturados (MUFAs) e ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs)14,15,16,17,18. Curiosamente, C. elegans é capaz de síntese de novo de todos os ácidos graxos necessários e enzimas centrais envolvidas na biossíntese, dessaturação e alongamento de ácidos graxos, facilitando a síntese de PUFAs de cadeia longa19. Diferente de outras espécies animais, C. elegans pode converter ácidos graxos ω-6 de 18 carbonos e 20 carbonos em ácidos graxos ω-3 com suas próprias enzimas ω-3 dessaturase. Além disso, os vermes possuem uma dessaturase Δ12 que catalisa a formação de ácido linoleico (LA) a partir do ácido oleico (OA, 18:1)20,21. A maioria dos animais ou plantas carece de dessaturações Δ12 e ω-3 e, portanto, depende da ingestão dietética de ω-6 e ω-3 para obter seus PUFAs, enquanto C. elegans não requer ácidos graxos dietéticos22. Mutantes isolados sem enzimas dessaturase funcionais têm sido usados para estudar as funções de ácidos graxos específicos em processos biológicos distintos, incluindo reprodução, crescimento, longevidade e neurotransmissão. O efeito de ácidos graxos individuais em vias biológicas específicas pode ser abordado tanto por meio de uma abordagem genética quanto de suplementação dietética16,17,23. Até o momento, a pesquisa lipídica tem se concentrado em caracterizar genes envolvidos na síntese, degradação, armazenamento e quebra lipídica em condições neurológicas e de desenvolvimento24. No entanto, os papéis dos lipídios na regulação da longevidade estão apenas começando a ser revelados.
Sinalização lipídica na regulação da longevidade Os lipídios desempenham papéis cruciais na regulação da longevidade, ativando cascatas de sinalização celular em tecidos e tipos de células distintos. Estudos recentes têm destacado os papéis ativos dos lipídios na modulação da transcrição e da comunicação célula-célula via proteínas ligadoras de lipídios ou no reconhecimento de receptores de membrana25. Além disso, a suplementação lipídica dietética oferece uma excelente ferramenta para dissecar como o metabolismo lipídico influencia a expectativa de vida em C. elegans. Distintos MUFAs e PUFAs demonstraram promover a longevidade ativando fatores de transcrição26,27.
Modelos de longevidade, incluindo a sinalização insulina/IGF-1 e a ablação de células precursoras da linha germinativa, estão associados à via de biossíntese MUFA, e a suplementação de MUFA, incluindo ácido oleico, ácido palmitoléico e cis-vaccênico, é suficiente para prolongar a vida útil de C. elegans 26. Embora o efeito de longevidade conferido pela administração de MUFA exija uma investigação mais aprofundada, o mecanismo subjacente provavelmente será mediado pelo fator de transcrição SKN-1/Nrf2, que é um ativador chave da resposta ao estresse oxidativo e da regulação da longevidade28,29. Entre os MUFAs, uma classe particular de etanolamidas-acila gordurosas chamadas N-aciletanolaminas (NAEs) desempenha papéis cruciais em mecanismos distintos, incluindo inflamação, alergias, aprendizado, memória e metabolismo energético30. Particularmente, a molécula lipídica conhecida como oleoiletanamida (OEA) foi identificada como um regulador positivo da longevidade, promovendo a translocação da proteína de ligação lipídica 8 (LBP-8) para o núcleo para ativar os receptores hormonais nucleares NHR-49 e NHR-807. A suplementação do análogo da OEA KDS-5104 é suficiente para prolongar a vida útil e induz a expressão de genes envolvidos nas respostas oxidativas ao estresse e na β-oxidação mitocondrial 7,8.
Ao mesmo tempo, o papel dos PUFAs também tem sido associado à regulação da longevidade. A administração de ácido graxo PUFA ω-3 α-linolênico (ALA) promove a longevidade ativando os fatores de transcrição NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF e induzindo a β-oxidação mitocondrial31. Curiosamente, os produtos peroxidados de ALA, referidos como oxilipinas, ativam o SKN-1/NRF, sugerindo que tanto os PUFAs quanto seus derivados oxidativos podem conferir benefícios de longevidade23. A suplementação de ácido graxo ω-6 ácido araquidônico (AA) e ácido dihomo-γ-linolênico (DGLA) prolonga a vida útil por meio da ativação da autofagia, promovendo o controle de qualidade proteico e resultando na degradação de agregados proteicos desperdiçados e tóxicos27,32. Mais recentemente, uma regulação de sinalização celular não autônoma mediada pela proteína de ligação lipídica 3 (LBP-3) e DGLA tem se mostrado crucial para promover a longevidade, enviando sinais periféricos aos neurônios, sugerindo um papel de longo alcance das moléculas lipídicas na comunicação intertecidual em níveis sistêmicos33. O presente estudo relata cada etapa para a realização da suplementação lipídica com bactérias semeadas em placas ou suspensão bacteriana em cultura líquida. Essas metodologias são usadas para avaliar a expectativa de vida e a análise transcricional, empregando conteúdo de corpo inteiro ou tecidos dissecados derivados de alguns vermes. As técnicas a seguir podem ser adaptadas a uma variedade de estudos nutricionais e oferecem uma ferramenta válida para dissecar como o metabolismo lipídico influencia a longevidade e o envelhecimento saudável.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Pestle</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>93-165P15</td>
			<td>For worm grinding with Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9639-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix</td>
			<td>GenDEPOT</td>
			<td>R5600</td>
			<td>For reverse transcription from bulk worm samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A28567</td>
			<td>For qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>C1248</td>
			<td>For spin down PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8&#34; tip</td>
			<td>Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td>100-132-888R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8503-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424 R centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444R</td>
			<td>For RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf vapo protect mastercycler pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>665180</td>
			<td>12-well plates for licuid feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>664161</td>
			<td>For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm</td>
			<td>Neta Scientific</td>
			<td>628161</td>
			<td>For worm6-cm NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PX1835-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole hydrochloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SPCML1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipl-4Tg</td>
			<td>MCW Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transgenic C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipl-4Tg;fat-3(wa22)</td>
			<td>MCW Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Transgenic C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Base</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12795-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4483354</td>
			<td>96-well qPCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied BioSystem</td>
			<td>4311971</td>
			<td>For sealing the 96-well qPCR plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10 Water Purification System</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z00Q0V0WW</td>
			<td>Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>C. elegans wild isolate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For measuring RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bacteria used as C. elegans food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4&#183;3H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green cells-to-Ct kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4402953</td>
			<td>For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4367659</td>
			<td>For qPCR from bulk worm samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Bright germicidal ultra bleach&#160;</td>
			<td>KIK International LLC.</td>
			<td>59647210143</td>
			<td>6% house bleach For worm egg preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td>Watch glass for dissecting the worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SX0590-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#183;7H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7500-4337</td>
			<td>For bacteria collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Sorvall ST 8 centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7500-7200</td>
			<td>For worm egg preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>TheroFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNA-free kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>For removing DNA contamination in RNA extractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer 59</td>
			<td>Denville Scientific INV</td>
			<td>S7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>For worm grinding with Trizol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm picker</td>
			<td>WormStuff</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid supplementation for longevity and gene transcriptional analysis in caenorhabditis elegans

O envelhecimento é um processo complexo caracterizado por mudanças fisiológicas progressivas resultantes de contribuições ambientais e genéticas. Os lipídios são cruciais na constituição de componentes estruturais das membranas celulares, no armazenamento de energia e como moléculas sinalizadoras. A regulação do metabolismo lipídico e da sinalização é essencial para ativar vias distintas de longevidade. A lombriga Caenorhabditis elegans é um organismo excelente e poderoso para dissecar a contribuição do metabolismo lipídico e da sinalização na regulação da longevidade. Vários estudos de pesquisa descreveram como a suplementação dietética de moléculas lipídicas específicas pode prolongar a vida útil de C. elegans ; no entanto, pequenas diferenças nas condições de suplementação podem causar problemas de reprodutibilidade entre os cientistas em diferentes laboratórios. Aqui, dois métodos detalhados de suplementação para C. elegans são relatados empregando suplementação lipídica com bactérias semeadas em placas ou suspensão bacteriana em cultura líquida. Também são fornecidos aqui os detalhes para realizar ensaios de vida útil com suplementação lipídica ao longo da vida e análise qRT-PCR usando um lisado de verme inteiro ou tecidos dissecados derivados de alguns vermes. Usando uma combinação de estudos longitudinais e investigações transcricionais sobre a suplementação lipídica, os ensaios de alimentação fornecem abordagens confiáveis para dissecar como os lipídios influenciam a longevidade e o envelhecimento saudável. Essa metodologia também pode ser adaptada para várias abordagens de triagem nutricional para avaliar mudanças em um subconjunto de transcritos usando um pequeno número de tecidos dissecados ou alguns animais.

Validação de alterações transcricionais usando alguns vermes inteiros após suplementação lipídica Para investigar se o protocolo de extração e retrotranscrição de RNA em cDNA de alguns vermes inteiros é reprodutível e comparável com os dados de vermes a granel, uma cepa de verme de longa duração superexpressando a lipase láptica lisossômica lipl-4 no intestino foi empregada 7,8,33,35.</s...

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Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

O presente protocolo descreve métodos de suplementação lipídica em culturas líquidas e a placas para Caenorhabditis elegans, juntamente com estudos longitudinais e análise transcricional gênica a granel ou de alguns vermes e tecidos de vermes.

Suplementação lipídica para longevidade e análise transcricional gênica em Caenorhabditis elegans

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

Este protocolo descreve duas estratégias de suplementação lipídica com uma combinação de análise longitudinal e transcricional no organismo modelo, C.elegans. A técnica descreve como examinar as mudanças transcricionais usando poucos vermes ou tecidos de vermes dissecados e como a alimentação líquida de uma população de insetos poderia ser acoplada a técnicas hidráulicas. Os indivíduos que realizam essa técnica devem praticar a dissecção tecidual devido à curta janela de tempo para realizar o experimento para alcançar a análise transcricional adequada.Para começar, colete as bactérias OP50 centrifugando a cultura cultivada durante a noite a 4.000 G por 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Suspenda o pellet bacteriano em 20 mililitros de diluição bacteriana, restrição alimentar ou base BDR por vórtice e, novamente, repita a centrifugação por 10 minutos.Depois de descartar o sobrenadante, ressuspeite o pellet bacteriano no meio BDR para preparar um estoque bacteriano 20 X BDR. Dilua o estoque bacteriano para 5X usando um meio BDR antes do uso. Usando etanol ou sulfóxido de dimetilo como solvente, prepare uma solução de estoque lipídico em um novo frasco de vidro autoclavado e encha o frasco de vidro com argônio ou nitrogênio para evitar a oxidação.Transfira a solução de estoque lipídico para a solução de bactérias BDR para atingir a concentração final desejada nas condições de alimentação. Misture bem por vórtice por 20 segundos. Preparar o veículo controlado misturando os mesmos volumes de etanol filtrado ou sulfóxido de dimetilo com bactérias BDR.Realizar suplementação lipídica e cultura líquida transferindo a quantidade desejada de controle lipídico ou veicular para cada poço de uma placa de 12 poços com três a quatro repetições para cada condição de alimentação. Misture a suspensão sincronizada do verme Caenorrhabditis elegans com bactérias BDR 5X em uma proporção de um para um para atingir uma concentração final de 1.500 vermes por mililitro e 2,5X para bactérias. Em seguida, transfira dois mililitros da mistura de bactérias minhocas para cada poço da placa de 12 poços.Quando terminar, envolva a placa de 12 poços com papel alumínio e agite a placa em uma incubadora de 20 graus Celsius a 100 RPMM para o comprimento de incubação desejado. Para suplementação lipídica em placas, semeie um mililitro das bactérias condicionadas por lipídios no centro de um meio de crescimento de nematoides de 10 centímetros ou placa de ágar NGM. Certifique-se de que a solução de trabalho final seja vórtice várias vezes entre semear as duas placas ao trabalhar com um alto número de placas.Seque a placa no escuro dentro de um exaustor de biossegurança. Transfira 3000 vermes da cultura sincronizada de minhocas para a placa de 10 centímetros. Seque a placa em um exaustor de biossegurança até que os vermes que estavam nadando nas placas suplementadas com lipídios comecem a engatinhar.Uma vez seca, incube a placa condicionada por lipídios em uma incubadora de 20 graus Celsius pelo período de tempo desejado e, se estiver usando lipídios poli-insaturados, proteja a placa da luz. Preparar 20 microlitros de solução de lise final para cada amostra misturando 0,2 microlitros de DNase I com 19,8 microlitros de solução de lise num tubo de PCR e misturá-lo bem pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Para extrair o RNA do pequeno número de vermes inteiros, remova as bactérias transferindo 15 a 20 vermes do gramado bacteriano para uma placa de NGM recém-semeada.Transferir 15 a 20 vermes da placa NGM não semeada para o tubo de PCR contendo 20 microlitros da solução de lise final recém-preparada com o número mínimo de bactérias e incubar a reação de lise por cinco minutos à temperatura ambiente. Uma vez que a incubação acabou, mantenha a amostra em um bom banho de água fria e sonda sonicate os vermes quatro vezes, cinco segundos de cada vez com 30% de amplitude e pulso por 15 segundos entre cada tempo de sonicação. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante cinco minutos antes de adicionar dois microlitros de solução de paragem à reacção de lise e misturá-lo batendo suavemente.Incubar a reação por dois minutos à temperatura ambiente e, em seguida, colocar o tubo no gelo. Para extrair o RNA do tecido do verme, pegue cerca de 20 vermes do gramado bacteriano e coloque-os em uma placa de NGM fresca não semeada para remover as bactérias dos vermes. Transfira 20 vermes com o menor número possível de bactérias para um vidro de relógio contendo 500 microlitros de solução M9 contendo quatro levamisole micromolares.Quando os vermes estiverem imobilizados, disseque a linha germinativa ou o intestino usando uma agulha de calibre 25 que pode ser anexada à seringa de um mililitro. Usando uma pipeta de vidro autoclavada, transfira os tecidos dissecados para o tubo de PCR e deposite o tubo no gelo por dois minutos, permitindo a deposição do material no fundo. Remova o sobrenadante do tubo de PCR antes de adicionar 20 microlitros de solução de lise final e misture-o bem batendo em toque.Depois de incubar a reação de lise por cinco minutos, adicione dois microlitros de solução de parada e toque no tubo várias vezes. Incubar o tubo por dois minutos antes de prosseguir para a transcrição reversa. No estudo de validação, o RNA extraído de uma grande população e de alguns vermes mostrou indução semelhante dos genes de processamento de neuropeptídeos, egl-3 e egl-21.Isso sugere que a extração de RNA de alguns vermes pode ser uma alternativa válida às técnicas padrão de síntese de CDNA de grandes populações. No intestino dissecado dos vermes transgênicos lipl-4, suplementados com ácido dihomo-gama-linolênico, ou DGLA, os genes de processamento de neuropeptídeos neuronais não foram induzidos. A suplementação de DGLA em diferentes concentrações resgatou a extensão da vida útil nos vermes após a derrubada da gordura-3.Vermes com suplementação lipídica também podem ser processados para sequenciamento de RNA, proteômica, metabolômica e estudos comportamentais para identificar fenótipos adicionais sob essas condições específicas. Esta metodologia pode ser aplicada à pesquisa do envelhecimento, biologia lipídica e qualquer outra área de pesquisa que vise estabelecer uma relação entre um determinado fenótipo e um fator nutricional ou metabólito.

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

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Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Biologia

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Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

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Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

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Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

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A suplementação dietética de ácidos graxos poliinsaturados em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

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Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combinado nucleotídeos e proteínas extrações em Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Modelagem de Doenças Neurodegenerativas Associadas à Idade em Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...