Name: generating a reproducible model of mid-gestational maternal immune activation using poly(i:c) to study susceptibility and resilience in offspring
Uploaded: 2022-08-17T13:40:00
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Nous remercions la Dre Myka Estes pour sa persévérance à aborder la variabilité dans le modèle d’AIM chez la souris et tous les contributeurs d’Estes et al.8 pour leur travail qui a mené à l’élaboration du protocole méthodologique décrit ici. La recherche rapportée ici a été soutenue par NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) et NIMH T32MH112507 (K.P.).

Tous les protocoles sont effectués sous l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie-Davis.
1. Préparation des animaux
<ol><li>Lors de l’acquisition d’animaux, gardez les paramètres suivants cohérents pour assurer une reproductibilité maximale.<ol><li>Fournisseur et emplacement du fournisseur : comme indiqué précédemment, les souris sauvages de type C57BL/6J présentent des réponses dif...

L’infection maternelle modifie le cours du développement du cerveau chez l’homme et chez les rongeurs et les primates non humains 4,5,7. Ici, une procédure pour induire l’AMI chez les souris à un point temporel de mi-gestation en utilisant poly(I: C) est décrite. Cette méthode intègre l’évaluation du BIR avant la grossesse, ce qui augmente la reproductibilité et offre la possibilité d’étudier mécaniquement l...

Les données épidémiologiques établissent un lien entre l’infection maternelle et un risque accru de troubles psychiatriques et de troubles du spectre autistique (TSA)1,2,3,4,5,6,7. Le modèle murin MIA a été développé pour tester la causalité et le rôle mécaniste de l’IMA dans l’étiologie de ces troubles, ainsi que pour identifier des biomarqueurs moléculaires et développer des outils diagnostiques et thérapeutiques 4,6. Malgré l’utilité de ce modèle et sa popularité croissante, il existe une variabilité considérable dans les protocoles d’induction de l’AIM dans le domaine, ce qui rend difficile la comparaison des résultats entre les études et la répétition des résultats 8,9. En outre, la plupart des itérations du modèle n’étudient pas deux aspects translationnels importants de l’AIM : (i) de nombreux descendants sont résilients à l’AIM, et (ii) les descendants sensibles peuvent présenter des combinaisons distinctes de phénotypes8.
Pour générer un modèle d’AIM reproductible, les chercheurs doivent rapporter au moins une mesure quantitative de l’ampleur de l’AIM induite chez les mères. Pour induire l’AMI pendant la gestation, notre laboratoire effectue des injections intrapéritonéales (i.p.) du polyinositique viral double brin d’ARN mimétique : l’acide polycytidilique [poly(I:C)]. Le poly(I:C) induit une cascade immunitaire semblable aux virus de la grippe lorsqu’il est reconnu par le récepteur de type Toll 3 (TLR3)10. En conséquence, poly(I:C) active la réponse de phase aiguë qui entraîne une élévation rapide des cytokines pro-inflammatoires 8,11,12. Des études antérieures ont démontré que l’élévation des cytokines pro-inflammatoires, y compris l’interleukine-6 (IL-6), est nécessaire pour produire des anomalies comportementales et une neuropathologie chez la progéniture à la suite de MIA11,12,13. Ainsi, le taux d’IL-6 dans le sérum maternel recueilli pendant son pic à 2,5 heures après l’injection de poly(I:C) est une mesure quantitative convaincante de l’AIM qui peut être utilisée pour comparer les résultats entre les laboratoires dans le domaine.
Afin de générer un modèle MIA qui aborde les éléments translationnellement essentiels de la résilience et de la susceptibilité avec un seul protocole d’induction 8,14, les chercheurs peuvent combiner des approches d’induction typiques avec la caractérisation de l’immunoréactivité de base (BIR) de la mère avant la grossesse8. Récemment, on a découvert que les souris C57BL/6 femelles vierges présentent un large éventail de réponses IL-6 à une faible dose d’exposition au poly(I:C) avant la grossesse8. Ce n’est qu’un sous-ensemble de ces femelles qui produisent une progéniture sensible, et seulement à certaines amplitudes d’activation immunitaire dictées par la combinaison du BIR et dela dose 8 de poly(I:C). MIA induit des phénotypes dans un motif en U inversé; La progéniture présente les plus grandes aberrations comportementales et moléculaires lorsque les mères sont modérément immunoréactives et que l’ampleur de l’inflammation maternelle atteint, mais ne dépasse pas, une plage critique8. Ici, une méthode détaillée sur la façon de créer de manière fiable une progéniture résiliente et sensible avec des phénotypes comportementaux divergents à la suite d’une injection de poly(I: C) en milieu de gestation est fournie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl physiological endotoxin free saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Control and vehicle for Poly(I:C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219Z45</td>
			<td>Used to hold oil during tail bleed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% TGX gels</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancare Nestlets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9365966</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-tubulin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171I50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171304070M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23209</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>552-58457-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779-10G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental enrichment</td>
			<td>Bio-serv</td>
			<td>K3327 and K3322</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>Ethovision</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorsecent-tagged seondary ntibodies</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>925-32213 and 925-68072</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed)</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td>Use to lubricate tail during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14060040</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>#tlrl-pic-5</td>
			<td>Used to establish females&#39; BIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humane Mouse Restrainer</td>
			<td>AIMS</td>
			<td>1000</td>
			<td>Used to restrain mouse during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Software</td>
			<td>Licor</td>
			<td>5.2</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610737EDU</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>APX10031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette CB300 300&#956;l Serum capillary tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>16.440.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P0913</td>
			<td>Gestational induction of MIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-MEF2A</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab76063</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-STAT3</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>12640S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>Observer</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey blocking buffer (TBS)</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>927-50003</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>9140</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipure PBS</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>65054L</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal anti_TH</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P4101-150</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsonica Sonicator Q500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-338-282</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick blood stopper</td>
			<td>Petco</td>
			<td>17140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering stand</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08Y12QC73</td>
			<td>Used to hold capillary tube during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower seeds</td>
			<td>Bio-serv</td>
			<td>S5137-1</td>
			<td>Use to increase breeding efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set,</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171G5007M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>23209</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a reproducible model of mid-gestational maternal immune activation using poly(i:c) to study susceptibility and resilience in offspring

L’activation immunitaire maternelle (MIA) pendant la grossesse est systématiquement liée à un risque accru de troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques chez la progéniture. Les modèles animaux d’AIM sont utilisés pour tester la causalité, étudier les mécanismes et développer des diagnostics et des traitements pour ces troubles. Malgré leur utilisation répandue, de nombreux modèles MIA souffrent d’un manque de reproductibilité et presque tous ignorent deux aspects importants de ce facteur de risque: (i) de nombreux descendants sont résilients à l’AIM, et (ii) les descendants sensibles peuvent présenter des combinaisons distinctes de phénotypes. Pour augmenter la reproductibilité et modéliser à la fois la susceptibilité et la résilience à l’AIM, l’immunoréactivité de base (BIR) des souris femelles avant la grossesse est utilisée pour prédire quelles grossesses entraîneront une progéniture résiliente ou une progéniture présentant des anomalies comportementales et moléculaires définies après une exposition à l’AIM. Ici, une méthode détaillée d’induction de l’AIM par injection intrapéritonéale (i.p.) du poly(I:C) mimique viral double brin (ARNds) à 12,5 jours de gestation est fournie. Cette méthode induit une réponse inflammatoire aiguë chez la mère, ce qui entraîne des perturbations du développement cérébral chez la souris qui correspondent à des domaines similaires touchés dans les troubles psychiatriques et neurodéveloppementaux humains (NDD).

Tous les animaux exposés à 30 mg/kg de poly(I:C) à E12.5 ne produisent pas de progéniture avec des anomalies comportementales constantes 8,31. Bien que 30 mg/kg et 40 mg/kg de poly(I:C) produisent de manière fiable des comportements de maladie chez les mères, y compris une diminution des niveaux d’activité, des réponses hypothermiques et une perte de poids, et provoquent également des élévations significatives de l’IL-6, seul un sous-ensemble de po...

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Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using PolyI:C to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

L’infection maternelle est un facteur de risque de troubles neurodéveloppementaux. Les modèles murins d’activation immunitaire maternelle (AMI) peuvent élucider l’impact de l’infection sur le développement et le fonctionnement du cerveau. Ici, des lignes directrices générales et une procédure sont fournies pour produire une progéniture résistante et sensible exposée à l’AMI.

Génération d’un modèle reproductible d’activation immunitaire maternelle en milieu de gestation à l’aide de Poly(I:C) pour étudier la susceptibilité et la résilience de la progéniture

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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