Name: generating a reproducible model of mid-gestational maternal immune activation using poly(i:c) to study susceptibility and resilience in offspring
Uploaded: 2022-08-17T13:40:00
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Ringraziamo la dott.ssa Myka Estes per la sua persistenza nell'affrontare la variabilità nel modello MIA murino e tutti i contributori in Estes et al.8 per il loro lavoro che ha portato allo sviluppo del protocollo dei metodi qui descritti. La ricerca qui riportata è stata supportata da NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) e NIMH T32MH112507 (K.P.).

Tutti i protocolli sono eseguiti sotto l'approvazione dell'Università della California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione degli animali
<ol><li>Quando si acquisiscono animali, mantenere coerenti i seguenti parametri per garantire la massima riproducibilità.<ol><li>Fornitore e posizione del fornitore: come riportato in precedenza, i topi selvatici C57BL / 6J mostrano risposte diverse alla stessa dose di poli (I: C) a seconda del forni...

L'infezione materna altera il corso dello sviluppo cerebrale nell'uomo e sia nei roditori che nei primati non umani 4,5,7. Qui, viene delineata una procedura per indurre MIA nei topi a metà gestazione usando poli (I: C). Questo metodo incorpora la valutazione del BIR prima della gravidanza, che aumenta la riproducibilità e offre la possibilità di studiare meccanicamente i meccanismi che portano alla resilienza e alla suscetti...

L'evidenza epidemiologica collega l'infezione materna ad un aumentato rischio di malattie psichiatriche e NDD, tra cui la schizofrenia (SZ) e il disturbo dello spettro autistico (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Il modello murino MIA è stato sviluppato per testare la causalità e il ruolo meccanicistico del MIA nell'eziologia di questi disturbi, nonché per identificare biomarcatori molecolari esviluppare strumenti diagnostici e terapeutici 4,6. Nonostante l'utilità di questo modello e la sua crescente popolarità, vi è una notevole variabilità nei protocolli di induzione MIA all'interno del campo, rendendo difficile confrontare i risultati tra gli studi e replicare i risultati 8,9. Inoltre, la maggior parte delle iterazioni del modello non indaga due importanti aspetti traslazionali della MIA: (i) molti discendenti sono resilienti al MIA, e (ii) la prole suscettibile può mostrare combinazioni distinte di fenotipi8.
Per generare un modello MIA riproducibile, i ricercatori dovrebbero riportare almeno una misura quantitativa dell'entità del MIA indotto nelle dighe. Per indurre MIA durante la gestazione, il nostro laboratorio esegue iniezioni intraperitoneali (i.p.) del poliinositico mimica virale dell'RNA a doppio filamento: acido policitidilico [poli(I:C)]. Il poli(I:C) induce una cascata immunitaria simile ai virus influenzali in quanto riconosciuto dal recettore toll-like 3 (TLR3)10. Di conseguenza, il poli (I: C) attiva la risposta di fase acuta che si traduce in un rapido aumento delle citochine proinfiammatorie 8,11,12. Studi precedenti hanno dimostrato che l'elevazione delle citochine proinfiammatorie, inclusa l'interleuchina-6 (IL-6), è necessaria per produrre anomalie comportamentali e neuropatologia nella prole a seguito di MIA11,12,13. Pertanto, il livello di IL-6 nel siero materno raccolto durante il suo picco a 2,5 ore dopo l'iniezione di poli (I: C) è una misura quantitativa convincente di MIA che può essere utilizzata per confrontare i risultati tra i laboratori all'interno del campo.
Al fine di generare un modello MIA che affronti gli elementi traslazionalmente essenziali di resilienza e suscettibilità con un singolo protocollo di induzione 8,14, i ricercatori possono combinare approcci tipici di induzione con la caratterizzazione dell'immunoreattività basale (BIR) della madre prima della gravidanza8. Recentemente, è stato scoperto che topi C57BL / 6 femmine vergini mostrano una vasta gamma di risposte IL-6 a un'esposizione a basse dosi di poli (I: C) prima della gravidanza8. È solo un sottogruppo di queste femmine che continua a produrre prole suscettibile, e solo a certe grandezze di attivazione immunitaria come dettato dalla combinazione di BIR e poli (I: C) dose8. La MIA induce fenotipi in un pattern a U invertito; La prole mostra le maggiori aberrazioni comportamentali e molecolari quando le madri sono moderatamente immunoreattive e l'entità dell'infiammazione materna raggiunge, ma non supera, un intervallo critico8. Qui, viene fornito un metodo dettagliato su come creare in modo affidabile sia la prole resiliente che suscettibile con fenotipi comportamentali divergenti a seguito dell'iniezione gestazionale di poli (I: C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl physiological endotoxin free saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Control and vehicle for Poly(I:C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219Z45</td>
			<td>Used to hold oil during tail bleed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% TGX gels</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancare Nestlets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9365966</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-tubulin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171I50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171304070M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23209</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>552-58457-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779-10G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental enrichment</td>
			<td>Bio-serv</td>
			<td>K3327 and K3322</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>Ethovision</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorsecent-tagged seondary ntibodies</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>925-32213 and 925-68072</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed)</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td>Use to lubricate tail during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14060040</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>#tlrl-pic-5</td>
			<td>Used to establish females&#39; BIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humane Mouse Restrainer</td>
			<td>AIMS</td>
			<td>1000</td>
			<td>Used to restrain mouse during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Software</td>
			<td>Licor</td>
			<td>5.2</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610737EDU</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>APX10031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette CB300 300&#956;l Serum capillary tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>16.440.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P0913</td>
			<td>Gestational induction of MIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-MEF2A</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab76063</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-STAT3</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>12640S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>Observer</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey blocking buffer (TBS)</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>927-50003</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>9140</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipure PBS</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>65054L</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal anti_TH</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P4101-150</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsonica Sonicator Q500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-338-282</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick blood stopper</td>
			<td>Petco</td>
			<td>17140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering stand</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08Y12QC73</td>
			<td>Used to hold capillary tube during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower seeds</td>
			<td>Bio-serv</td>
			<td>S5137-1</td>
			<td>Use to increase breeding efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set,</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171G5007M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>23209</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a reproducible model of mid-gestational maternal immune activation using poly(i:c) to study susceptibility and resilience in offspring

L'attivazione immunitaria materna (MIA) durante la gravidanza è costantemente legata ad un aumentato rischio di disturbi dello sviluppo neurologico e neuropsichiatrico nella prole. I modelli animali di MIA sono utilizzati per testare la causalità, studiare i meccanismi e sviluppare diagnostica e trattamenti per questi disturbi. Nonostante il loro uso diffuso, molti modelli di MIA soffrono di una mancanza di riproducibilità e quasi tutti ignorano due aspetti importanti di questo fattore di rischio: (i) molti figli sono resilienti al MIA e (ii) la prole suscettibile può mostrare combinazioni distinte di fenotipi. Per aumentare la riproducibilità e modellare sia la suscettibilità che la resilienza alla MIA, l'immunoreattività basale (BIR) dei topi femmina prima della gravidanza viene utilizzata per prevedere quali gravidanze si tradurranno in prole resiliente o prole con anomalie comportamentali e molecolari definite dopo l'esposizione a MIA. Qui, viene fornito un metodo dettagliato per indurre MIA tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) del poli(I:C) mimica virale a doppio filamento (dsRNA) a 12,5 giorni di gestazione. Questo metodo induce una risposta infiammatoria acuta nella madre, che si traduce in perturbazioni nello sviluppo del cervello nei topi che mappano domini influenzati in modo simile nei disturbi psichiatrici e dello sviluppo neurologico umano (NDD).

Non tutti gli animali esposti a 30 mg/kg di poli (I:C) a E12.5 producono prole con anomalie comportamentali costanti 8,31. Sebbene sia 30 mg / kg che 40 mg / kg di poli (I: C) producano in modo affidabile comportamenti di malattia nelle dighe, tra cui diminuzione dei livelli di attività, risposte ipotermiche e perdita di peso, e causino anche aumenti significativi di IL-6, solo un sottogruppo di cucciolate esposte a MIA continuerà a sviluppare anomalie comporta...

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Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using PolyI:C to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

L'infezione materna è un fattore di rischio per i disturbi dello sviluppo neurologico. I modelli murini di attivazione immunitaria materna (MIA) possono chiarire l'impatto dell'infezione sullo sviluppo e sulla funzione del cervello. Qui vengono fornite linee guida generali e una procedura per produrre una prole resiliente e suscettibile esposta a MIA.

Generazione di un modello riproducibile di attivazione immunitaria materna a metà gestazionale utilizzando poli (I: C) per studiare la suscettibilità e la resilienza nella prole

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

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