Name: generating a reproducible model of mid-gestational maternal immune activation using poly(i:c) to study susceptibility and resilience in offspring
Uploaded: 2022-08-17T13:40:00
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마우스 MIA 모델의 가변성을 지속적으로 해결해 주신 Myka Estes 박사와 여기에 설명된 방법 프로토콜의 개발로 이어진 작업에 대해 Estes et al.8 의 모든 기여자에게 감사드립니다. 여기에 보고된 연구는 NIMH 2P50 MH106438-06(일명) 및 NIMH T32MH112507(K.P.)에 의해 뒷받침되었습니다.

모든 프로토콜은 University of California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인 하에 수행됩니다.
1. 동물 준비
<ol><li>동물을 획득할 때 최대한의 재현성을 보장하기 위해 다음 매개변수를 일관되게 유지하십시오.<ol><li>공급업체 및 공급업체 위치: 이전에 보고된 바와 같이, 야생형 C57BL/6J 마우스는 공급업체에 따라 동일한 용량의 폴리(I:C)에 대해 다른 반?...

모체 감염은 인간과 설치류 및 비인간 영장류 모두에서 뇌 발달 과정을 변화시킨다 4,5,7. 여기에서는 poly(I:C)를 사용하여 임신 중반 시점에서 마우스에서 MIA를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 임신 전 BIR 평가를 통합하여 재현성을 높이고 MIA에 대한 자손의 회복력과 감수성을 유발하는 메커니즘을 기계적으로 조사할 ?...

역학적 증거는 산모 감염을 정신분열증(SZ) 및 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 포함한 정신과 및 NDD의 위험 증가와 연관시킵니다1,2,3,4,5,6,7. MIA 마우스 모델은 이러한 장애의 병인에서 MIA의 인과관계와 기계론적 역할을 테스트하고 분자 바이오마커를 식별하고 진단 및 치료 도구를 모두 개발하기 위해 개발되었습니다 4,6. 이 모델의 유용성과 인기가 높아지고 있음에도 불구하고 현장 내에서 MIA 유도 프로토콜에는 상당한 변동성이 있어 연구 전반에 걸쳐 결과를 비교하고 결과를 복제하기가 어렵습니다 8,9. 또한, 이 모델의 대부분의 반복은 MIA의 두 가지 중요한 번역 측면을 조사하지 않는다: (i) 많은 자손이 MIA에 탄력적이고, (ii) 감수성이 있는 자손은 표현형의 뚜렷한 조합을 나타낼 수 있다8.
재현 가능한 MIA 모델을 생성하기 위해 조사관은 댐에서 유도된 MIA의 크기에 대한 정량적 측정을 하나 이상 보고해야 합니다. 임신 중 MIA를 유도하기 위해 우리 연구실은 이중 가닥 RNA 바이러스 모방 폴리이노시틱: 폴리시티딜산[폴리(I:C)]의 복강내(i.p.) 주사를 수행합니다. Poly(I:C)는 톨 유사 수용체 3(TLR3)10에 의해 인식되기 때문에 인플루엔자 바이러스와 유사한 면역 캐스케이드를 유도합니다. 그 결과, 폴리(I:C)는 전염증성 사이토카인 8,11,12의 급격한 상승을 초래하는 급성기 반응을 활성화시킨다. 이전 연구에서는 인터루킨-6(IL-6)을 포함한 전염증성 사이토카인의 상승이 MIA11,12,13의 결과로 자손의 행동 이상과 신경병리를 생성하는 데 필요하다는 것을 입증했습니다. 따라서 폴리(I:C) 주사 후 2.5시간에 최고조에 달하는 동안 수집된 모체 혈청의 IL-6 수준은 현장 내 실험실 간 결과를 비교하는 데 사용할 수 있는 MIA의 강력한 정량적 측정입니다.
단일 유도 프로토콜(single induction protocol)8,14을 사용하여 회복력(resilience)과 감수성(sceptibility)의 번역상 필수 요소들을 다루는 MIA 모델을 생성하기 위해, 연구자들은 전형적인 유도 접근법과 임신 전 댐의 기준선 면역반응성(BIR)의 특성화를 결합할 수 있다 8. 최근, 처녀 암컷 C57BL/6 마우스는 임신 전 폴리(I:C)에 저선량으로 노출되었을 때 광범위한 IL-6 반응을 보인다는 것이 발견되었다8. 감수성 자손을 낳는 것은 이러한 암컷의 일부일 뿐이며, BIR과 폴리(I:C) 용량의 조합에 의해 결정된 면역 활성화의 특정 크기에서만 가능하다8. MIA는 거꾸로 된 U 패턴으로 표현형을 유도합니다. 자손은 댐이 적당히 면역반응이 있을 때 가장 큰 행동 및 분자 이상을 보이며, 모체 염증의 크기는 임계 범위에 도달하지만 이를 초과하지는 않는다8. 여기에서는 poly(I:C)의 임신 중기 주사의 결과로 다양한 행동 표현형을 가진 탄력 있는 자손과 감수성 자손을 모두 안정적으로 생성하는 방법에 대한 자세한 방법을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl physiological endotoxin free saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Control and vehicle for Poly(I:C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219Z45</td>
			<td>Used to hold oil during tail bleed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% TGX gels</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>4561084</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ancare Nestlets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9365966</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-tubulin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3408</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171I50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171304070M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23209</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>552-58457-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779-10G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental enrichment</td>
			<td>Bio-serv</td>
			<td>K3327 and K3322</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>Ethovision</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorsecent-tagged seondary ntibodies</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>925-32213 and 925-68072</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed)</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td>Use to lubricate tail during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14060040</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>#tlrl-pic-5</td>
			<td>Used to establish females&#39; BIR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humane Mouse Restrainer</td>
			<td>AIMS</td>
			<td>1000</td>
			<td>Used to restrain mouse during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Software</td>
			<td>Licor</td>
			<td>5.2</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli buffer</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610737EDU</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex200</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>APX10031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvette CB300 300&#956;l Serum capillary tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>16.440.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P0913</td>
			<td>Gestational induction of MIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-MEF2A</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab76063</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-STAT3</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>12640S</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>Observer</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey blocking buffer (TBS)</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>927-50003</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx imaging system</td>
			<td>Li-cor</td>
			<td>9140</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipure PBS</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>65054L</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23227</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal anti_TH</td>
			<td>Pel-Freez</td>
			<td>P4101-150</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qsonica Sonicator Q500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-338-282</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick blood stopper</td>
			<td>Petco</td>
			<td>17140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering stand</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08Y12QC73</td>
			<td>Used to hold capillary tube during tail bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower seeds</td>
			<td>Bio-serv</td>
			<td>S5137-1</td>
			<td>Use to increase breeding efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set,</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>171G5007M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>23209</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a reproducible model of mid-gestational maternal immune activation using poly(i:c) to study susceptibility and resilience in offspring

임신 중 산모의 면역 활성화(MIA)는 자손의 신경 발달 및 신경 정신 장애의 위험 증가와 지속적으로 관련이 있습니다. MIA의 동물 모델은 인과관계를 테스트하고, 메커니즘을 조사하고, 이러한 장애에 대한 진단 및 치료법을 개발하는 데 사용됩니다. 이들의 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 MIA 모델은 재현성의 결여로 고통받고 거의 모든 것이 이 위험 인자의 두 가지 중요한 측면을 무시한다: (i) 많은 자손이 MIA에 탄력적이고, (ii) 감수성 자손은 표현형의 뚜렷한 조합을 나타낼 수 있다. 재현성을 높이고 MIA에 대한 감수성과 탄력성을 모두 모델링하기 위해 임신 전 암컷 마우스의 기본 면역반응성(BIR)을 사용하여 MIA에 노출된 후 어떤 임신이 회복력 있는 자손 또는 정의된 행동 및 분자 이상을 가진 자손을 낳을지 예측합니다. 여기서, 임신 12.5일에 이중 가닥 RNA(dsRNA) 바이러스 모방 폴리(I:C)의 복강내(i.p.) 주사를 통해 MIA를 유도하는 상세한 방법이 제공됩니다. 이 방법은 댐에서 급성 염증 반응을 유도하여 인간 정신 및 신경 발달 장애(NDD)에서 유사하게 영향을 받는 영역에 매핑되는 마우스의 뇌 발달 교란을 유발합니다.

E12.5에서 30mg/kg의 폴리(I:C)에 노출된 모든 동물이 일관된 행동 이상을 가진 자손을 생산하는 것은 아닙니다 8,31. 30mg/kg과 40mg/kg의 폴리(I:C)는 모두 활동 수준 감소, 저체온 반응 및 체중 감소를 포함하여 댐에서 질병 행동을 안정적으로 생성하고 IL-6의 상당한 상승을 유발하지만, MIA에 노출된 새끼의 하위 집합만이 인간 정신과 및 NDD에서 관찰되는 것과 유...

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Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using PolyI:C to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

산모 감염은 신경 발달 장애의 위험 요소입니다. 모체 면역 활성화(MIA)의 마우스 모델은 감염이 뇌 발달 및 기능에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다. 여기에서는 MIA에 노출된 안정적으로 회복력 있고 감수성이 있는 자손을 생산하기 위한 일반적인 지침과 절차가 제공됩니다.

자손의 감수성과 회복력을 연구하기 위해 Poly(I:C)를 사용하여 임신 중기 모체 면역 활성화의 재현 가능한 모델 생성

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

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