Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology at JoVE.com

该项目由UF佳得乐奖启动包（X.T.），UFHCC飞行员奖（X.T.和Dietmar Siemann博士），UF机会种子基金（X.T.）和UFHCC大学学者计划（H.Y.Wang）资助。我们衷心感谢Jonathan Licht博士（UFHCC），Rolf Renne博士（UFHCC），Christopher Vulpe博士（UFHCC），Blanka Sharma博士（BME），Mark Sheplak博士（MAE和ECE），Daniel Ferris博士（BME），Malisa Sarntinoranont博士（MAE），Ashok Kumar博士（MAE），Benjamin Keselowsky博士（BME），Brent Gila博士（RSC），Philip Feng博士（ECE）的智力讨论和技术支持， Gregory A. Hudalla博士（BME），Steven Ghivizzani博士（OSSM），Yenisel Cruz-Almeida博士（CDBS），Roger Fillingim博士（CD-BS），Robert Caudle博士（OMS），John Neubert博士（DN-OR），Justin Hiliard博士（神经外科），田和博士（哈佛大学），谭友华博士（香港理工大学），Jessie L-S Au博士（定量系统药理学研究所），David Hahn博士（亚利桑那大学）， 尼康支持团队（Jose Serrano-Velez博士、Larry Kordon博士和Jon Ekman博士）。我们非常感谢Tang's，Yamaguchi's，Sharma's，Au's，Siemann's和Guan研究实验室的所有成员以及UF MAE部门的所有工作人员的有效支持。

1. 维持 CRISPR/Cas9 工程化的 B2B 细胞
<ol><li>在补充有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的RPMI-1640的T25烧瓶中培养B2B细胞。</li>
	<li>将B2B细胞保持在37°C的加湿培养箱中，并含有5%CO2。</li>
	<li>当汇合度达到70%至80%时传代培养B2B细胞。</li>
	<li>将B2B细胞系储存在RPMI-1640培养基中，在-80°C冰箱中含有10%（v / v）DMSO。</li>
	<li>在实验中使用传代数小于10的B2B细胞。</li>
</ol><stron...

磁性微珠的内化（第2.2节）至关重要，因为细胞外微珠不能直接对细胞核施加力。力施加和成像（第5.3节）是本实验中的关键步骤，使细胞核变形并引起有意义的生物学后果所需的力可能取决于样品。该实验中的力大小（0.8 nN和1.4 nN）可以进一步增加，以触发不太敏感的细胞中的核机械传感。
为了以高通量定量方式施加磁力，单个微珠的内化是一种理想的方法。在这项研究?...

本研究旨在通过将直接施加机械力的磁致动器和同时成像结构和功能亚细胞变化的共聚焦荧光显微镜相结合，开发和应用一种新技术来阐明细胞核力学生物学。细胞感知细胞外生物物理信号，包括组织硬度1，2，3，4、间质流体压力和剪切应力5、6、7、表面拓扑/几何形状8、9、10、11、12 和拉伸/压缩应力 13，14，15，16.生物物理信号被转化为生化信号，并触发基因表达和细胞行为的潜在下游变化 - 这一过程称为机械转导17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27.为了研究机械转导过程，已经开发了无数技术来对细胞施加机械力，例如原子力显微镜28，细胞拉伸装置29，bio-MEMS（微机电系统）力传感器15，30，31，剪切流变学32和立体视觉系统33.最近的一篇综述总结了应用细胞外机械线索和干扰机械传感的方法34。迄今为止，这些方法中的大多数都对细胞质膜施加力，细胞通过膜受体（如整合素、钙粘蛋白、离子通道和 G 蛋白偶联受体）直接接收这些细胞外生物物理信号。随后，它们将信号传输到细胞内细胞骨架和细胞核。例如，使用yes相关蛋白（YAP）易位作为机械传感的指标，显示细胞从细胞膜感知底物刚度和细胞外张力的机械信号，并通过细胞骨架将它们传递到细胞核中以诱导YAP细胞质到细胞核易位28，35。
最近的证据表明，细胞核本身是一个独立的机械传感器8，36，37。对从细胞中收获的分离细胞核进行的实验证明了这一点，其中发现细胞核响应直接施加在它们上的机械力而自适应地改变其刚度36。在许多生理条件下，肿瘤和健康细胞中的细胞核都能感知细胞外生物物理信号并改变其机械性能和组装38，39，40。例如，在外渗时，肿瘤细胞的核硬度降低并保持柔软度超过24小时38。在通过密闭间质空间迁移的过程中，肿瘤细胞的细胞核经常失去并恢复其结构完整性39。然而，细胞核感知生物物理信号的方式尚不清楚，尽管已发现涉及几种核包膜蛋白和蛋白质家族，例如核粘连蛋白A / C和核骨架和细胞骨架（LINC）复合物38，41的接头。因此，可以直接向细胞核施加力的新型非侵入性方法将使力传递的效果与细胞 - 质膜和细胞骨架解耦，并将有助于阐明以前无法进入的核机械传感分子机制。
使用光镊操纵细胞器42 和注射到细胞43 中的微珠的研究表明，直接对细胞核施加力的技术能力。然而，光学镊子技术有几个局限性：（1）低通量光学镊子通常一次只能操作一个细胞或微珠;（2）核的潜在光损伤和温度伪影变形需要数十pN36，相应的必要激光功率约为每pN10 mW 44，45。这样的激光强度足以在实验过程中触发细胞中的光损伤并扰乱细胞功能46。
通过活细胞内的微珠施加的磁力显示出直接对细胞核施加力的潜力，并克服了光镊的局限性。一旦微珠被输送到细胞质中，磁场就可以以高通量的方式同时对多个微珠施加磁力。磁场不影响细胞功能47，但产生从pN到nN的力，足以诱发核变形36，48，49。迄今为止，磁性微珠的操作已应用于细胞质膜48，细胞质50内部，F-肌动蛋白51，细胞核内47和分离的细胞核36。然而，微珠的磁操作从未被用于在核包膜上施加直接的机械力来研究原子核中的机械转导。
在本文中，开发了一种简单的技术，将磁性微珠无创地递送到细胞质中，并使用这些微珠在细胞核上施加机械力（图1）。在这里，使用CRISPR / Cas9工程的内源性表达mNeonGreen21-10/11标记的YAP的人正常B2B细胞系来验证该方法。YAP是一种机械敏感蛋白，YAP的易位受核机械传感14，28的调节。选择CRISPR / Cas9调控的敲入方法用荧光蛋白（FP）mNeonGreen21-10/11标记内源性YAP。尽管已知CRISPR编辑具有不完全效率和脱靶效应，但先前出版物中的协议集成了荧光分选以选择正确的开放阅读框插入52，53，54。通过这种额外的选择层，在先前产生的20+细胞系中未观察到脱靶标记事件52，53，54，55。这是一种分裂的荧光蛋白构建体，但原则上，任何可表达的荧光标签都可以使用。这种标记方法优于转基因或抗体方法。首先，与转基因表达不同，标记蛋白保持单拷贝基因剂量并在天然基因调控网络的生理背景下表达，从而限制了蛋白质浓度、定位和相互作用的偏差。本研究中使用的标记方法比全FP标记实现了超过数量级的吞吐量和效率。它还避免了由于固定伪影和高质量、高特异性抗体的可用性有限而导致的与免疫荧光相关的挑战。其次，本文中使用的方法对细胞生理学的干扰最小，并且能够真实地实时揭示所有内源性YAPs。相比之下，其他常见的转基因方法通常会导致YAP的过表达。由此产生的人工分布可能引起细胞毒性并影响细胞的机械传感56，57，58。
本研究提出了一种方案，通过传递到细胞质中的磁性微珠直接对细胞核施加力，并同时进行活细胞荧光成像。总之，这里介绍的方案演示了如何（1）在细胞核外将磁性微珠递送到细胞中，（2）操纵微珠以在细胞核上施加磁力，（3）在操作过程中对细胞进行共聚焦荧光成像，以及（4）在整个力施加过程中定量分析YAP核/细胞质（N / C）比率。结果表明：（1）通过内吞作用，磁性微珠可以在7 h内无创递送到B2B细胞的细胞质中（图2和图3）;（2）直接施加在细胞核上的量化磁力（图4，图5和图6）可以触发CRISPR / Cas9工程B2B细胞中YAP N / C比率的各种变化（图7和图8）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

机械生物学的一个基本问题是活细胞如何在细胞生理学和病理学的背景下感知细胞外机械刺激。细胞外机械刺激的细胞机械感觉被认为是通过膜受体、相关的蛋白质复合物和细胞骨架。机械生物学的最新进展表明，细胞质本身的细胞核可以同时独立地感知机械刺激。然而，缺乏对细胞核如何感知、转导和响应机械刺激的机制理解，主要是因为通过传统工具访问和量化细胞核力学的技术挑战。本文描述了一种新型磁力致动器的设计、制造和实现，该致动器应用精确和非侵入性的 3D 机械刺激直接使细胞核变形。使用CRISPR / Cas9工程细胞，这项研究表明，该工具与高分辨率共聚焦荧光成像相结合，能够揭示单细胞中机械敏感yes相关蛋白（YAP）的实时动力学作为细胞核变形的函数。这种简单的方法有可能弥合机械生物学界当前的技术差距，并为细胞核机械转导与细胞功能之间关系中存在的知识差距提供答案。

磁力移动装置的设计及磁力的应用 为了通过磁微珠对原子核施加力，设计并建造了一个磁铁移动装置来控制磁铁的空间位置。磁铁移动设备包含一个中央框架、三个旋钮和导轨，用于以每个周期 1.59 mm 的空间分辨率在 x、y 和 z 方向上独立移动连接的磁铁（图 1A）。一旦磁体靠近输送到细胞中的7μm微珠（图1B），它就会磁力吸引微珠并在...

Watch this Scientific Journal Video about Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology at JoVE.com

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

本研究提出了一种新的方案，通过传递到细胞质中的磁性微珠直接对细胞核施加机械力，并同时进行活细胞荧光成像。

结合3D磁力致动器和多功能荧光成像来研究细胞核力学生物学

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

在这种方法中，力直接施加到原子核上。这解耦了细胞质膜和细胞骨架的力传递效应，揭示了核机械传感的分子机制。该力以非侵入性方式施加在活细胞内。与光镊相比，磁场和磁力不会影响细胞功能，并且具有更高的吞吐量。通过称量0.2克平均直径为7微米的羰基铁微珠，开始用磁性微珠培养细胞。使用移液管将微珠悬浮在一毫升RPMI 1640培养基中。然后将带有B2B细胞的培养皿带到生物安全柜中，并快速将200微升含有微珠的培养基加入培养皿中。将培养皿放入培养箱中，直到微珠被细胞内化。打开倒置显微镜并使用共聚焦荧光成像，通过可视化微珠、细胞核和细胞边界，每六小时确定细胞系内化的最佳时间。内化的微珠将存在于细胞边界内。对于小力应用和活细胞成像，请打开软件应用程序元素。要定义磁性查找的配置，请单击“一加二”按钮将扫描速度设置为每两秒一帧。将针孔尺寸设置为 1.2 通风单位。仅检查FITC通道，并将PMT HV设置为70，偏移为零，激光强度为10。要定义磁性 YAP 核的配置，请单击“四过一”按钮，将扫描速度设置为每四秒一帧。然后单击 1.2 艾里单位按钮，将针孔尺寸设置为 1.2 艾里单位并检查 FITC 通道。将PMT HV设置为70，偏移为零，激光强度设置为10。为了成像细胞核边界和核染色强度，请检查花青5通道。请勿单击 1.2 Airy 单位按钮并将 PMT HV 设置为 70，偏移为零，激光强度设置为 10。针孔尺寸将针对三维YES相关蛋白质成像进行优化。接下来，通过元素打开 DIA。打开旋转视图，使用明场并调整对象的焦点，以获得清晰的细胞聚焦图像。使用10X物镜在三种条件下找到合适的多个单细胞，例如细胞内部只有一个微珠，内部有多个微珠，内部没有任何微珠。然后切换到40X物镜，并用适当的位置编号命名这个位置。打开元素，单击磁性查找，删除互锁，然后扫描选项卡，然后选择顶部和底部按钮以调整焦平面的Z位置，以设置所选单元格的Z堆栈的下限和上限。再次单击扫描停止扫描。切换到磁性 YAP 核配置并将文件名设置为 before_small_force.nd2。单击带有记录的 Z 堆栈的运行按钮。切换到正确的光路并打开 DIA。 打开旋转视图并单击录制按钮。通过旋转磁铁移动设备的旋钮，将磁铁移动到培养皿底部上方 46 毫米处。保存并检查视频以确认磁力引起的微珠位移。通过将文件名设置为 after_small_force.nd2 来重复扫描过程。接下来，切换到正确的光路，打开 DIA 并打开旋转视图，然后单击录制按钮。将磁铁移动设备旋钮旋转至培养皿底部上方120毫米处，并保存明场图像序列或视频。通过将文件名设置为 before_large_force.nd2 来重复扫描步骤。微珠在FITC或花青5通道的激光激发下不能发出荧光。因此，内化的微珠通过位于YES相关蛋白质和细胞核荧光共聚焦成像中的暗空洞进行鉴定。核循环性显示对照细胞和微珠内化细胞之间没有显着差异。与微珠共培养但未内化的对照细胞和具有微珠内化的细胞的YES相关蛋白细胞核与细胞质比也显示出无显着差异。肌动蛋白的细胞核变形和解聚是由含细胞骨架细胞中微珠施加的压缩力引起的。定量成像分析提供的定量AFM力位移关系提供的校准曲线。基于这种关系，估计了珠子施加的力。在施加或释放磁力时观察到细胞核变形和YES相关的蛋白质易位。绿色通道中YES相关蛋白的强度变化和红色通道中细胞核染色的无变化证实了磁力诱导的核变形是由YES相关蛋白易位引发的。两组内YES相关蛋白核与细胞质比的净变化的定量证实，施加在细胞质内微珠上的磁力诱导了YES相关蛋白易位并改变了YES相关蛋白核与细胞质的比值。在施加力和成像之前，请确保细胞已内化磁性微珠并且磁珠在细胞边界内。

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

测试的速度和运动方向的视觉灵敏度在蜥蜴

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

科研

生物学

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

分离纯化果蝇</em磁性微球的排序>外周神经元

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

有丝分裂的siRNA转染后的时间推移成像

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

模仿人类小分子RNA的LightSwitch萤光素酶检测系统使用3&#39;UTR记者构造的microRNA识别目标在贴壁细胞

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

单病毒原子力显微镜和超分辨率荧光成像的样品制备

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

结合单分子操纵和成像蛋白-DNA相互作用的研究

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

肿瘤细胞球体的高通量图像分析：一个用户友好的软件应用来测量球体的大小自动准确

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

结合母细胞和波动测试磁分选，以分析基因组不稳定性的过程中有丝分裂细胞衰老<em&gt;酿酒酵母</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

适用于比色金纳米粒子检测方法的选择结构切换适配方法

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...