Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
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Ce projet est financé par UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), le UFHCC Pilot Award (X. T. et Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) et UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Nous apprécions sincèrement les discussions intellectuelles et le soutien technique du Dr Jonathan Licht (UFHCC), du Dr Rolf Renne (UFHCC), du Dr Christopher Vulpe (UFHCC), du Dr Blanka Sharma (BME), du Dr Mark Sheplak (MAE & ECE), du Dr Daniel Ferris (BME), du Dr Malisa Sarntinoranont (MAE), du Dr Ashok Kumar (MAE), du Dr Benjamin Keselowsky (BME), du Dr Brent Gila (RSC), du Dr Philip Feng (ECE), Dr Gregory A. Hudalla (BME), Dr Steven Ghivizzani (OSSM), Dr Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr Roger Fillingim (CD-BS), Dr Robert Caudle (OMS), Dr John Neubert (DN-OR), Dr Justin Hiliard (neurochirurgie), Dr Tian He (Université Harvard), Dr Youhua Tan (Université polytechnique de Hong Kong), Dr Jessie L-S Au (Institut de pharmacologie des systèmes quantitatifs), Dr David Hahn (Université de l’Arizona), et l’équipe de soutien de Nikon (Drs Jose Serrano-Velez, Larry Kordon et Jon Ekman). Nous sommes profondément reconnaissants pour le soutien efficace de tous les membres des laboratoires de recherche de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann et Guan et de tous les membres du personnel du département UF MAE.

1. Maintenance des cellules B2B conçues par CRISPR/Cas9
<ol><li>Culture de cellules B2B dans une fiole T25 avec RPMI-1640 supplémentée avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine.</li>
	<li>Maintenir les cellules B2B dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2.</li>
	<li>Sous-culture des cellules B2B lorsque la confluence atteint 70% à 80%.</li>
	<li>Conservez la lignée cellulaire B2B dans un milieu de culture RPMI-1640 contenant 10 % (v/v) de DMSO dan...

L’internalisation des microbilles magnétiques (section 2.2) est essentielle parce que les microbilles extracellulaires ne peuvent pas appliquer de force directement sur le noyau. L’application de force et l’imagerie (section 5.3) sont des étapes critiques dans cette expérience, et la force nécessaire pour déformer le noyau et induire des conséquences biologiques significatives pourrait dépendre de l’échantillon. L’amplitude de la force dans cette expérience (0,8 nN et 1,4 nN) peut encore être augment?...

Cette étude vise à développer et à appliquer une nouvelle technique pour élucider la mécanobiologie du noyau en combinant les actionneurs magnétiques qui appliquent une force mécanique directement sur le noyau cellulaire et la microscopie confocale à fluorescence qui imagera simultanément les changements subcellulaires structurels et fonctionnels. Les cellules détectent les signaux biophysiques extracellulaires, y compris la rigidité tissulaire 1,2,3,4, la pression du fluide interstitiel et la contrainte de cisaillement 5,6,7, la topologie/géométrie de surface 8,9,10,11,12 et la contrainte de tension/compression13,14, 15,16. Les signaux biophysiques sont convertis en signaux biochimiques et déclenchent des changements potentiels en aval de l’expression génique et des comportements cellulaires - un processus connu sous le nom de mécanotransduction 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Pour étudier les processus de mécanotransduction, une myriade de techniques ont été développées pour appliquer une force mécanique sur les cellules, telles que la microscopie à force atomique28, le dispositif d’étirement cellulaire29, le capteur de force bio-MEMS (systèmes micro-électromécaniques) 15,30,31, la rhéologie de cisaillement 32 et le système de vision stéréoscopique 33 . Une revue récente résume les approches pour appliquer des signaux mécaniques extracellulaires et interférer avec la mécanodétection34. À ce jour, la plupart de ces méthodes appliquent une force sur la membrane plasmique cellulaire, et les cellules reçoivent directement ces signaux biophysiques extracellulaires via des récepteurs membranaires tels que l’intégrine, la cadhérine, les canaux ioniques et les récepteurs couplés aux protéines G. Par la suite, ils transmettent le signal au cytosquelette intracellulaire et au noyau. Par exemple, en utilisant la translocation de protéines associées à l’oui (YAP) comme indicateur de mécano-détection, il est démontré que les cellules détectent les signaux mécaniques de rigidité du substrat et de tension extracellulaire de la membrane cellulaire et les transmettent à travers le cytosquelette dans le noyau pour induire la translocation du cytoplasme au noyauYAP 28,35.
Des preuves récentes suggèrent que le noyau cellulaire lui-même est un mécano-capteur indépendant 8,36,37. Ceci est prouvé par des expériences effectuées sur le noyau isolé prélevé sur des cellules, où il a été révélé que les noyaux modifient adaptativement leur rigidité en réponse à la force mécanique directement appliquée sur eux36. Au cours de nombreuses conditions physiologiques, les noyaux des cellules tumorales et saines détectent les signaux biophysiques extracellulaires et modifient leurs propriétés mécaniques et leurs assemblages38,39,40. Par exemple, lors de l’extravasation, la rigidité nucléaire des cellules tumorales diminue et maintient la douceur pendant plus de 24 h38. Au cours de la migration à travers l’espace interstitiel confiné, les noyaux des cellules tumorales perdent fréquemment et retrouvent leur intégrité structurelle39. Cependant, la façon dont le noyau détecte le signal biophysique est inconnue, bien que plusieurs protéines d’enveloppe nucléaire et familles de protéines se soient révélées impliquées, telles que Lamin A / C et linker of nucleoskeleton and cytoskeleton complex (LINC)38,41. Par conséquent, de nouvelles méthodes non invasives capables d’appliquer directement une force au noyau découpleront l’effet de la transmission de la force de la membrane cellule-plasma et du cytosquelette, et aideront à élucider les mécanismes moléculaires auparavant inaccessibles de la mécano-détection nucléaire.
Les recherches utilisant des pincettes optiques pour manipuler les organites42 et les microbilles injectées dans les cellules43 ont montré la capacité technologique d’appliquer directement une force sur le noyau. Cependant, la technique de la pince optique présente plusieurs limites : (1) les pinces optiques à faible débit ne manipulent souvent qu’une seule cellule ou microbille à la fois; et (2) les photodommages potentiels et la déformation des artefacts de température du nucléaire nécessitent des dizaines de pN36, et la puissance laser nécessaire correspondante est d’environ 10 mW par pN44,45. Une telle intensité laser est suffisante pour déclencher des photodommages dans les cellules et perturber les fonctions cellulaires au cours de l’expérience46.
La force magnétique appliquée à travers les microbilles dans les cellules vivantes montre le potentiel d’appliquer directement une force sur le noyau et surmonte les limites des pincettes optiques. Une fois que les microbilles sont livrées dans le cytoplasme, un champ magnétique peut exercer une force magnétique sur plusieurs microbilles simultanément à haut débit. Le champ magnétique n’influence pas les fonctions cellulaires47, mais génère une force de pN à nN, ce qui est suffisant pour induire une déformation nucléaire 36,48,49. À ce jour, la manipulation de microbilles magnétiques a été appliquée sur la membrane plasmique cellulaire48, à l’intérieur du cytoplasme50, sur la F-actine51, à l’intérieur du noyau47 et sur le noyauisolé 36. Cependant, la manipulation magnétique des microbilles n’a jamais été utilisée pour appliquer une force mécanique directe sur l’enveloppe nucléaire afin d’étudier la mécanotransduction dans le noyau.
Dans cet article, une technique simple est développée pour délivrer de manière non invasive des microbilles magnétiques dans le cytoplasme et utiliser ces microbilles pour appliquer une force mécanique sur le noyau (Figure 1). Ici, des lignées cellulaires B2B humaines normales conçues par CRISPR / Cas9 qui expriment de manière endogène mNeonGreen21-10/11-marqué YAP sont utilisées pour valider la méthode. YAP est une protéine mécano-sensible, et la translocation de YAP est régulée par le mécano-détection nucléaire 14,28. L’approche knock-in régulée par CRISPR/Cas9 a été choisie pour marquer le YAP endogène avec une protéine fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Bien que l’édition CRISPR soit connue pour avoir une efficacité incomplète et un effet hors cible, les protocoles des publications précédentes ont intégré le tri par fluorescence pour sélectionner l’insertion correcte d’un cadre de lecture ouvert52,53,54. Avec cette couche supplémentaire de sélection, aucun événement de marquage hors cible n’a été observé dans 20+ lignées cellulaires précédemment générées52,53,54,55. Il s’agit d’une construction protéique fluorescente divisée, mais en principe, n’importe quelle étiquette fluorescente exprimable pourrait être utilisable. Cette approche de marquage est supérieure aux méthodes de transgène ou d’anticorps. Premièrement, contrairement à l’expression transgénique, la protéine marquée maintient le dosage du gène en une seule copie et s’exprime dans le contexte physiologique du réseau de régulation des gènes natifs, limitant ainsi les écarts dans la concentration, la localisation et l’interaction des protéines. La méthode de marquage utilisée dans cette étude permet d’atteindre un débit et une efficacité supérieurs d’un ordre de grandeur à ceux du marquage FP complet. Il évite également les défis associés à l’immunofluorescence en raison des artefacts de fixation et de la disponibilité limitée d’anticorps de haute qualité et de haute spécificité. Deuxièmement, l’approche utilisée dans cet article perturbe le moins possible la physiologie cellulaire et permet la révélation en temps réel de tous les YAP endogènes de manière authentique. En revanche, d’autres méthodes transgéniques courantes conduisent souvent à une surexpression de YAP. La distribution artificielle qui en résulte peut potentiellement provoquer une cytotoxicité et affecter la mécano-détection des cellules56,57,58.
Cette étude présente un protocole permettant d’appliquer directement une force sur le noyau par le biais de microbilles magnétiques introduites dans le cytoplasme et de réaliser simultanément une imagerie fluorescente de cellules vivantes. En résumé, les protocoles présentés ici démontrent comment (1) délivrer des microbilles magnétiques dans la cellule à l’extérieur du noyau, (2) manipuler les microbilles pour appliquer une force magnétique sur le noyau, (3) effectuer une imagerie confocale fluorescente des cellules pendant la manipulation et (4) analyser quantitativement le rapport nucléaire / cytoplasme YAP (N / C) tout au long du processus d’application de la force. Les résultats suggèrent que (1) par endocytose, les microbilles magnétiques peuvent être livrées de manière non invasive dans le cytoplasme des cellules B2B en 7 heures (Figure 2 et Figure 3); et (2) la force magnétique quantifiée directement appliquée sur le noyau (Figure 4, Figure 5 et Figure 6) seule peut déclencher divers changements du rapport YAP N/C dans les cellules B2B modifiées par CRISPR/Cas9 (Figure 7 et Figure 8).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

Une question fondamentale en mécanobiologie est de savoir comment les cellules vivantes perçoivent les stimuli mécaniques extracellulaires dans le contexte de la physiologie et de la pathologie cellulaires. On pense que la mécano-sensation cellulaire des stimuli mécaniques extracellulaires se fait à travers les récepteurs membranaires, le complexe protéique associé et le cytosquelette. Les progrès récents de la mécanobiologie démontrent que le noyau cellulaire du cytoplasme lui-même peut détecter indépendamment simultanément les stimuli mécaniques. Cependant, une compréhension mécaniste de la façon dont le noyau cellulaire détecte, transduit et répond aux stimuli mécaniques fait défaut, principalement en raison des défis techniques liés à l’accès et à la quantification de la mécanique du noyau par des outils conventionnels. Cet article décrit la conception, la fabrication et la mise en œuvre d’un nouvel actionneur de force magnétique qui applique des stimuli mécaniques 3D précis et non invasifs pour déformer directement le noyau cellulaire. En utilisant des cellules modifiées par CRISPR/Cas9, cette étude démontre que cet outil, combiné à l’imagerie confocale fluorescente à haute résolution, permet la révélation de la dynamique en temps réel d’une protéine associée oui (YAP) mécano-sensible dans des cellules individuelles en fonction de la déformation du noyau. Cette méthode simple a le potentiel de combler le fossé technologique actuel dans la communauté de la mécanobiologie et de fournir des réponses au manque de connaissances qui existe dans la relation entre la mécanotransduction du noyau et la fonction cellulaire.

Conception d’un dispositif de déplacement d’aimant et application d’une force magnétique Pour appliquer une force sur le noyau à travers les microbilles magnétiques, un dispositif de déplacement d’aimant a été conçu et construit pour contrôler la position spatiale de l’aimant. Le dispositif de déplacement de l’aimant contient un cadre central, trois boutons et des rails pour déplacer l’aimant attaché dans les directions x, y et z indépendamment à la résolution spatiale de ...

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Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Cette étude présente un nouveau protocole pour appliquer directement une force mécanique sur le noyau cellulaire par le biais de microbilles magnétiques livrées dans le cytoplasme et pour effectuer simultanément l’imagerie fluorescente de cellules vivantes.

Combinaison d’un actionneur de force magnétique 3D et d’une imagerie par fluorescence multifonctionnelle pour étudier la mécanobiologie du noyau

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

Dans cette méthode, la force est directement appliquée au noyau. Cela découple l’effet de transmission de force de la membrane plasmique cellulaire et du cytosquelette, révélant les mécanismes moléculaires de la mécanodétection nucléaire. La force est appliquée dans les cellules vivantes de manière non invasive.Par rapport aux pinces optiques, le champ magnétique et la force magnétique n’affectent pas les fonctions de la cellule et ont un débit plus élevé. Commencez à cultiver les cellules avec des microbilles magnétiques en pesant 0,2 gramme de microbilles de fer carbonyle ayant sept micromètres de diamètre moyen. Suspendre les microbilles dans un milieu de culture RPMI 1640 d’un millilitre à l’aide d’une pipette.Ensuite, apportez la boîte de Petri avec des cellules B2B à l’armoire de biosécurité et ajoutez rapidement 200 microlitres du milieu contenant des microbilles dans la boîte de Pétri. Mettez la boîte de Petri dans un incubateur jusqu’à ce que les microbilles soient internalisées par les cellules. Ouvrez le microscope inversé et, à l’aide de l’imagerie confocale par fluorescence, déterminez le moment optimal pour l’internalisation des lignées cellulaires toutes les six heures en visualisant la limite microbille, nucléaire et cellulaire.Les microbilles internalisées seront présentes à l’intérieur des limites cellulaires. Pour les applications à petite force et l’imagerie de cellules sous tension, ouvrez l’application logicielle Elements. Pour définir la recherche magnétique de configuration, cliquez sur le bouton un sur deux pour définir la vitesse de numérisation sur une image toutes les deux secondes.Définissez la taille du sténopé sur 1,2 unité Airy. Vérifiez uniquement le canal FITC et réglez PMT HV sur 70, décalage sur zéro, intensité laser sur 10. Pour définir le noyau YAP magnétique de configuration, définissez la vitesse de numérisation sur une image toutes les quatre secondes en cliquant sur le bouton un sur quatre.Cliquez ensuite sur le bouton de l’unité 1.2 Airy pour définir la taille du sténopé sur 1.2 Airy unit et vérifiez le canal FITC. Réglez PMT HV sur 70, décalage sur zéro, intensité laser sur 10. Pour l’imagerie de la limite du noyau et de l’intensité de la coloration nucléaire, vérifiez le canal cyanine 5.Ne cliquez pas sur le bouton de l’unité 1.2 Airy et réglez PMT HV sur 70, décalage sur zéro et intensité laser sur 10. La taille du sténopé sera optimisée pour l’imagerie protéique tridimensionnelle associée à YES. Ensuite, activez le DIA via Elements.Ouvrez la vue de rotation, utilisez un fond clair et ajustez la mise au point de l’objet pour obtenir une image nette des cellules. Utilisez un objectif 10X pour trouver plusieurs cellules individuelles appropriées dans trois conditions, comme une cellule avec une seule microbille à l’intérieur, avec plusieurs microbilles à l’intérieur et sans microbille à l’intérieur. Ensuite, passez à l’objectif 40X et nommez cette position avec le numéro de position approprié.Ouvrez Eléments, cliquez sur Recherche magnétique, supprimez le verrouillage, puis scannez les onglets, puis sélectionnez les boutons supérieur et inférieur pour ajuster la position Z du plan focal afin de définir les limites inférieure et supérieure de la pile Z des cellules sélectionnées. Arrêtez l’analyse en cliquant à nouveau sur Analyser. Passez à la configuration du noyau YAP magnétique et définissez le nom de fichier sur before_small_force.nd2.Cliquez sur le bouton d’exécution avec la pile Z enregistrée. Passez au bon chemin lumineux et activez DIA. Ouvrez la vue spin et cliquez sur le bouton d’enregistrement.Déplacez l’aimant à 46 millimètres au-dessus du fond de la boîte de Petri en faisant tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant. Enregistrez et regardez la vidéo pour confirmer le déplacement des microbilles induit par la force magnétique. Répétez la procédure d’analyse en définissant le nom de fichier comme after_small_force.nd2.Ensuite, passez à la bonne trajectoire de lumière, activez DIA et ouvrez la vue de rotation avant de cliquer sur le bouton d’enregistrement. Faites tourner le bouton du dispositif de déplacement de l’aimant jusqu’à 120 millimètres au-dessus du fond de la boîte de Petri et enregistrez une séquence d’images ou une vidéo en fond clair. Répétez les étapes d’analyse en définissant le nom de fichier sur before_large_force.nd2.Les microbilles ne peuvent pas émettre de fluorescence sous excitation laser dans le canal FITC ou cyanine 5. Ainsi, les microbilles internalisées ont été identifiées par le creux foncé situé dans l’imagerie confocale de fluorescence de la protéine et du noyau associés à YES. La circularité nucléaire n’a montré aucune différence significative entre les cellules témoins et les cellules avec internalisation des microbilles.Le rapport noyau de cellules protéiques associées à la YES au cytoplasme des cellules témoins co-cultivées avec des microbilles mais sans internalisation et des cellules avec internalisation des microbilles n’a pas non plus montré de différence significative. La déformation du noyau et la dépolymérisation de l’actine ont été causées par la force de compression appliquée par les microbilles dans les cellules contenant le cytosquelette. Courbe d’étalonnage de l’analyse d’imagerie quantitative fournie par la relation quantitative de déplacement de force AFM.Sur la base de cette relation, la force appliquée aux perles a été estimée. La déformation du noyau et la translocation protéique associée à YES ont été observées lors de l’application ou de la libération de la force magnétique. Les changements d’intensité de la protéine associée à YES dans le canal vert et aucun changement dans la coloration du noyau dans le canal rouge ont confirmé que la déformation nucléaire induite par la force magnétique déclenchée par la translocation de protéines associées à YES.La quantification de la variation nette du rapport noyau de protéines associées à la YES au cytoplasme au sein de deux groupes a confirmé que la force magnétique appliquée aux microbilles dans le cytoplasme induisait la translocation de protéines associées à YES et modifiait le rapport noyau protéique associé à YES. Avant d’appliquer la force et l’imagerie, assurez-vous que les cellules ont internalisé les microbilles magnétiques et que les billes sont à l’intérieur des limites cellulaires.

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