Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
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Dieses Projekt wird durch das UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), den UFHCC Pilot Award (X. T. und Dr. Dietmar Siemann), den UF Opportunity Seed Fund (X. T.) und das UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang) finanziert. Wir schätzen die intellektuellen Gespräche und die fachliche Unterstützung durch Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), und Support-Team von Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon und Jon Ekman). Wir sind zutiefst dankbar für die effektive Unterstützung durch alle Mitglieder der Forschungslabors von Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann und Guan sowie alle Mitarbeiter der UF MAE-Abteilung.

1. Wartung von CRISPR/Cas9-entwickelten B2B-Zellen
<ol><li>Kultur von B2B-Zellen in einem T25-Kolben mit RPMI-1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin.</li>
	<li>Die B2B-Zellen werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 gehalten.</li>
	<li>Subkultur der B2B-Zellen, wenn der Konfluenz 70% bis 80% erreicht.</li>
	<li>Lagern Sie die B2B-Zelllinie in RPMI-1640 Kulturmedium mit 10% (v/v) DMSO in einem -80 °C Gefrierschrank.</li>
	<li>Verwenden Si...

Die Internalisierung magnetischer Mikroperlen (Abschnitt 2.2) ist von entscheidender Bedeutung, da extrazelluläre Mikroperlen keine Kraft direkt auf den Kern ausüben können. Krafteinleitung und Bildgebung (Abschnitt 5.3) sind kritische Schritte in diesem Experiment, und die Kraft, die benötigt wird, um den Kern zu verformen und sinnvolle biologische Konsequenzen zu induzieren, könnte probenabhängig sein. Die Kraftstärke in diesem Experiment (0,8 nN und 1,4 nN) kann weiter erhöht werden, um die nukleare Mechano-Se...

Diese Studie zielt darauf ab, eine neue Technik zur Aufklärung der Kernmechanobiologie zu entwickeln und anzuwenden, indem die magnetischen Aktoren, die mechanische Kraft direkt auf den Zellkern ausüben, und die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die gleichzeitig die strukturellen und funktionellen subzellulären Veränderungen abbildet, kombiniert werden. Zellen erfassen extrazelluläre biophysikalische Signale einschließlich Gewebesteifigkeit 1,2,3,4, interstitiellen Flüssigkeitsdruck und Scherspannung 5,6,7, Oberflächentopologie/-geometrie 8,9,10,11,12 und Zug-/Druckspannung13,14, 15,16. Biophysikalische Signale werden in biochemische Signale umgewandelt und lösen mögliche nachgeschaltete Veränderungen der Genexpression und des Zellverhaltens aus - ein Prozess, der als Mechanotransduktion bekannt ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Um Mechanotransduktionsprozesse zu untersuchen, wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um mechanische Kraft auf die Zellen auszuüben, wie Rasterkraftmikroskopie28, Zelldehnungsgerät29, Bio-MEMS (mikroelektromechanische Systeme) Kraftsensor 15,30,31, Scherrheologie 32 und Stereo Vision System 33 . Eine kürzlich durchgeführte Übersicht fasst die Ansätze zur Anwendung extrazellulärer mechanischer Hinweise und zur Störung der Mechanosensorik zusammen34. Bisher üben die meisten dieser Methoden Kraft auf die Zellplasmamembran aus, und Zellen empfangen diese extrazellulären biophysikalischen Signale direkt über Membranrezeptoren wie Integrin, Cadherin, Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Anschließend leiten sie das Signal an das intrazelluläre Zytoskelett und den Zellkern weiter. Zum Beispiel wird gezeigt, dass Zellen unter Verwendung der YAP-Translokation (Yes-assoziiertes Protein) als Indikator für die Mechano-Sensorik die mechanischen Signale der Substratsteifigkeit und extrazellulären Spannung von der Zellmembran wahrnehmen und durch das Zytoskelett in den Zellkern übertragen, um eine YAP-Zytoplasma-zu-Zellkern-Translokation zu induzieren28,35.
Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Zellkern selbst ein unabhängiger Mechanosensorist 8,36,37. Dies wird durch Experimente bewiesen, die an dem isolierten Kern aus Zellen durchgeführt wurden, wo gezeigt wurde, dass Kerne ihre Steifigkeit adaptiv als Reaktion auf die mechanische Kraft ändern, die direkt auf sie ausgeübt wird36. Unter vielen physiologischen Bedingungen nehmen Kerne sowohl in Tumor- als auch in gesunden Zellen extrazelluläre biophysikalische Signale wahr und verändern ihre mechanischen Eigenschaften und Anordnungen38,39,40. Zum Beispiel nimmt bei Extravasation die Kernsteifigkeit von Tumorzellen ab und hält die Weichheit für mehr als 24 h38 aufrecht. Während der Migration durch den begrenzten interstitiellen Raum verlieren die Kerne von Tumorzellen häufig ihre strukturelle Integrität und gewinnen sie wieder39. Die Art und Weise, wie der Zellkern das biophysikalische Signal wahrnimmt, ist jedoch unbekannt, obwohl mehrere Kernhüllproteine und Proteinfamilien beteiligt sind, wie Lamin A / C und Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) -Komplex38,41. Neue nicht-invasive Methoden, die direkt Kraft auf den Zellkern ausüben können, werden daher die Wirkung der Kraftübertragung von der Zell-Plasma-Membran und dem Zytoskelett entkoppeln und dazu beitragen, die bisher unzugänglichen molekularen Mechanismen der nuklearen Mechano-Sensorik aufzuklären.
Forschungen, die optische Pinzetten zur Manipulation von Organellen42 und Mikroperlen, die in Zellen43 injiziert wurden, verwendeten, zeigten die technologische Fähigkeit, direkt Kraft auf den Kern auszuüben. Die optische Pinzettentechnik hat jedoch mehrere Einschränkungen: (1) optische Pinzetten mit niedrigem Durchsatz manipulieren oft nur eine Zelle oder Mikroperle gleichzeitig; und (2) potentielle Photoschäden und Temperaturartefakt-Verformungen von Kernkern erfordern Dutzende von pN36, und die entsprechende notwendige Laserleistung beträgt etwa 10 mW pro pN44,45. Eine solche Laserintensität ist ausreichend, um Photoschäden in den Zellen auszulösen und die Zellfunktionen während des Experiments46 zu stören.
Die magnetische Kraft, die durch Mikroperlen in lebenden Zellen ausgeübt wird, zeigt das Potenzial, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und überwindet die Einschränkungen optischer Pinzetten. Sobald Mikroperlen in das Zytoplasma abgegeben werden, kann ein Magnetfeld eine magnetische Kraft auf mehrere Mikrokügelchen gleichzeitig und mit hohem Durchsatz ausüben. Das Magnetfeld beeinflusst nicht die Zellfunktionen47, sondern erzeugt Kraft von pN nach nN, was ausreicht, um eine Kernverformung 36,48,49 zu induzieren. Bisher wurde die Manipulation magnetischer Mikroperlen an der Zellplasmamembran48, im Zytoplasma50, an F-Aktin51, im Kern47 und am isolierten Kern36 angewendet. Die magnetische Manipulation von Mikroperlen wurde jedoch nie verwendet, um direkte mechanische Kraft auf die Kernhülle auszuüben, um die Mechanotransduktion im Kern zu untersuchen.
In dieser Arbeit wird eine einfache Technik entwickelt, um nicht-invasiv magnetische Mikroperlen in das Zytoplasma zu transportieren und diese Mikroperlen zu verwenden, um mechanische Kraft auf den Kern auszuüben (Abbildung 1). Hier werden CRISPR/Cas9-entwickelte humane normale B2B-Zelllinien, die endogen mNeonGreen21-10/11-markiertes YAP exprimieren, verwendet, um die Methode zu validieren. YAP ist ein mechanosensitives Protein, und die Translokation von YAP wird durch nukleare mechano-sensingreguliert 14,28. Der CRISPR/Cas9-regulierte Knock-in-Ansatz wurde gewählt, um endogenes YAP mit einem fluoreszierenden Protein (FP) mNeonGreen21-10/11 zu markieren. Obwohl bekannt ist, dass die CRISPR-Bearbeitung eine unvollständige Effizienz und einen Off-Target-Effekt hat, integrierten die Protokolle in früheren Publikationen eine Fluoreszenzsortierung, um die korrekte Einfügung des offenen Leserahmens52,53,54 auszuwählen. Mit dieser zusätzlichen Selektionsschicht wurde in 20+ Zelllinien, die zuvor52,53,54,55 erzeugt wurden, kein Off-Target-Tagging-Ereignis beobachtet. Dies ist ein Split-Fluoreszenzprotein-Konstrukt, aber im Prinzip könnte jede ausdrückbare fluoreszierende Markierung verwendbar sein. Dieser Markierungsansatz ist Transgen- oder Antikörpermethoden überlegen. Erstens behält das markierte Protein im Gegensatz zur Transgenexpression die Einzelkopie-Gendosierung bei und exprimiert im physiologischen Kontext des nativen genregulatorischen Netzwerks, wodurch Abweichungen in Proteinkonzentration, Lokalisation und Interaktion begrenzt werden. Die in dieser Studie verwendete Tagging-Methode erreicht über eine Größenordnung einen höheren Durchsatz und eine höhere Effizienz als das vollständige FP-Tagging. Es vermeidet auch Herausforderungen im Zusammenhang mit Immunfluoreszenz aufgrund von Fixierungsartefakten und der begrenzten Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern mit hoher Spezifität. Zweitens führt der in dieser Arbeit verwendete Ansatz eine minimale Störung der Zellphysiologie durch und ermöglicht die authentische Offenbarung aller endogenen YAPs in Echtzeit. Im Gegensatz dazu führen andere gängige Transgenmethoden oft zu einer Überexpression von YAP. Die daraus resultierende künstliche Verteilung kann möglicherweise Zytotoxizität verursachen und die mechano-sensing von Zellenbeeinflussen 56,57,58.
Diese Studie stellt ein Protokoll vor, um durch magnetische Mikroperlen, die in das Zytoplasma abgegeben werden, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und gleichzeitig eine Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Protokolle, wie man (1) magnetische Mikroperlen in die Zelle außerhalb des Kerns liefert, (2) die Mikroperlen manipuliert, um magnetische Kraft auf den Kern auszuüben, (3) konfokale fluoreszierende Bildgebung der Zellen während der Manipulation durchführt und (4) das YAP-Kern- / Zytoplasma-Verhältnis (N / C) während des gesamten Kraftanwendungsprozesses quantitativ analysiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) durch Endozytose magnetische Mikrokügelchen innerhalb von 7 h nicht-invasiv in das Zytoplasma von B2B-Zellen abgegeben werden können (Abbildung 2 und Abbildung 3); und (2) quantifizierte magnetische Kraft, die direkt auf den Kern ausgeübt wird (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6), kann allein verschiedene Änderungen des YAP N / C-Verhältnisses in CRISPR / Cas9-B-Zellen auslösen (Abbildung 7 und Abbildung 8).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

Eine grundlegende Frage in der Mechanobiologie ist, wie lebende Zellen extrazelluläre mechanische Reize im Kontext der Zellphysiologie und -pathologie wahrnehmen. Es wird angenommen, dass die zelluläre Mechano-Empfindung extrazellulärer mechanischer Reize durch die Membranrezeptoren, den zugehörigen Proteinkomplex und das Zytoskelett erfolgt. Jüngste Fortschritte in der Mechanobiologie zeigen, dass der Zellkern im Zytoplasma selbst selbstständig mechanische Reize gleichzeitig wahrnehmen kann. Ein mechanistisches Verständnis darüber, wie der Zellkern mechanische Reize wahrnimmt, umleitet und darauf reagiert, fehlt jedoch, hauptsächlich aufgrund der technischen Herausforderungen beim Zugriff auf und der Quantifizierung der Kernmechanik mit herkömmlichen Werkzeugen. Dieses Papier beschreibt das Design, die Herstellung und die Implementierung eines neuen magnetischen Kraftaktors, der präzise und nicht-invasive mechanische 3D-Reize anwendet, um den Zellkern direkt zu verformen. Unter Verwendung von CRISPR/Cas9-Zellen zeigt diese Studie, dass dieses Werkzeug in Kombination mit hochauflösender konfokaler fluoreszierender Bildgebung die Aufdeckung der Echtzeitdynamik eines mechanosensitiven yes-assoziierten Proteins (YAP) in einzelnen Zellen als Funktion der Kernverformung ermöglicht. Diese einfache Methode hat das Potenzial, die derzeitige Technologielücke in der Mechanobiologie zu schließen und Antworten auf die Wissenslücke zu geben, die in der Beziehung zwischen Kernmechanotransduktion und Zellfunktion besteht.

Entwurf einer magnetbeweglichen Vorrichtung und Anwendung der Magnetkraft Um Kraft auf den Kern durch die magnetischen Mikroperlen auszuüben, wurde eine magnetbewegliche Vorrichtung entworfen und gebaut, um die räumliche Position des Magneten zu steuern. Die magnetbewegliche Vorrichtung enthält einen zentralen Rahmen, drei Drehknöpfe und Schienen, um den angebrachten Magneten unabhängig voneinander in x-, y- und z-Richtung mit der räumlichen Auflösung von 1,59 mm pro Zyklus zu bewegen (<strong ...

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Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.

Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

Bei dieser Methode wird die Kraft direkt auf den Kern ausgeübt. Dadurch entkoppelt sich der Kraftübertragungseffekt von der Zellplasmamembran und dem Zytoskelett und enthüllt die molekularen Mechanismen der Kernmechanosensing. Die Kraft wird in den lebenden Zellen nicht-invasiv angewendet.Im Vergleich zu optischen Pinzetten beeinflussen das Magnetfeld und die Magnetkraft die Zellfunktionen nicht und haben einen höheren Durchsatz. Beginnen Sie mit der Kultivierung der Zellen mit magnetischen Mikroperlen, indem Sie 0,2 Gramm Carbonyleisen-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von sieben Mikrometern wiegen. Die Mikrokügelchen werden mit einer Pipette in einem Milliliter RPMI 1640-Kulturmedium aufgehängt.Dann bringen Sie die Petrischale mit B2B-Zellen zur Biosicherheitswerkbank und geben schnell 200 Mikroliter des Mediums mit Mikroperlen in die Petrischale. Legen Sie die Petrischale in einen Inkubator, bis Mikroperlen von den Zellen verinnerlicht sind. Öffnen Sie das inverse Mikroskop und bestimmen Sie mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzbildgebung alle sechs Stunden den optimalen Zeitpunkt für die Internalisierung der Zelllinien, indem Sie die Mikroperlen-, Kern- und Zellgrenze visualisieren.Die internalisierten Mikrokügelchen werden innerhalb der Zellgrenze vorhanden sein. Öffnen Sie für die Anwendung kleiner Kräfte und die Bildgebung lebender Zellen die Softwareanwendung Elements. Um die magnetische Suche in der Konfiguration zu definieren, klicken Sie auf die Schaltfläche eins über zwei, um die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro zwei Sekunden einzustellen.Stellen Sie die Lochgröße auf 1,2 Airy-Einheit ein. Überprüfen Sie nur den FITC-Kanal und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um den magnetischen YAP-Kern für die Konfiguration zu definieren, stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf ein Bild pro vier Sekunden ein, indem Sie auf die Schaltfläche eins über vier klicken.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche 1.2 Airy-Einheit, um die Lochgröße auf 1.2 Airy-Einheit einzustellen und den FITC-Kanal zu überprüfen. Stellen Sie PMT HV auf 70, versetzt auf Null, Laserintensität auf 10 ein. Um die Kerngrenze und die Intensität der Kernfärbung abzubilden, überprüfen Sie den Cyanin-5-Kanal.Klicken Sie nicht auf die Taste 1.2 Airy Unit und stellen Sie PMT HV auf 70, Offset auf Null und Laserintensität auf 10 ein. Die Pinhole-Größe wird für die dreidimensionale YES-assoziierte Proteinbildgebung optimiert. Aktivieren Sie als Nächstes die DIA über Elemente.Öffnen Sie die Spin-Ansicht, verwenden Sie ein Hellfeld und passen Sie den Fokus des Objekts an, um ein klares Bild der Zellen im Fokus zu erhalten. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv, um mehrere einzelne Zellen unter drei Bedingungen zu finden, z. B. eine Zelle mit einer einzelnen Mikroperle im Inneren, mit mehreren Mikroperlen im Inneren und ohne Mikroperle im Inneren. Wechseln Sie dann zum 40X-Objektiv und benennen Sie diese Position mit der entsprechenden Positionsnummer.Öffnen Sie Elemente, klicken Sie auf Magnetsuche, entfernen Sie die Verriegelung, scannen Sie dann Registerkarten und wählen Sie dann die oberen und unteren Tasten, um die Z-Position der Fokusebene anzupassen, um die untere und obere Grenze für den Z-Stapel der ausgewählten Zellen festzulegen. Beenden Sie den Scanvorgang, indem Sie erneut auf Scan klicken. Wechseln Sie zur magnetischen YAP-Kernkonfiguration und setzen Sie den Dateinamen auf before_small_force.nd2.Klicken Sie auf den Run-Button mit dem aufgezeichneten Z-Stack. Wechseln Sie zum rechten Lichtpfad und schalten Sie DIA ein. Öffnen Sie die Spin-Ansicht und klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche.Bewegen Sie den Magneten auf 46 Millimeter über dem Petrischalenboden, indem Sie den Knopf der Magnetbewegungsvorrichtung drehen. Speichern und überprüfen Sie das Video, um die durch Magnetkraft induzierte Mikroperlenverschiebung zu bestätigen. Wiederholen Sie den Scanvorgang, indem Sie den Dateinamen auf after_small_force.nd2 festlegen.Wechseln Sie anschließend zum rechten Lichtpfad, schalten Sie DIA ein und öffnen Sie die Spin-Ansicht, bevor Sie auf die Aufnahmeschaltfläche klicken. Drehen Sie den Magnet-Moving-Device-Knopf bis zu 120 Millimeter über dem Petrischalenboden und speichern Sie eine Hellfeld-Bildsequenz oder ein Video. Wiederholen Sie die Schritte zum Scannen, indem Sie den Dateinamen auf before_large_force.nd2 setzen.Die Mikrokügelchen können unter Laseranregung im FITC- oder Cyanin-5-Kanal keine Fluoreszenz emittieren. So wurden die internalisierten Mikrokügelchen durch die dunkle Mulde identifiziert, die sich in der konfokalen Bildgebung der Fluoreszenz von YES-assoziiertem Protein und Zellkern befindet. Die Kernzirkularität zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen Kontrollzellen und Zellen mit Mikroperleninternalisierung.Das YES-assoziierte Proteinzellkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis von Kontrollzellen, die mit Mikroperlen, aber ohne Internalisierung kokultiviert wurden, und Zellen mit Mikroperleninternalisierung zeigten ebenfalls keinen signifikanten Unterschied. Die Kernverformung und Depolymerisation von Aktin wurde durch die Kompressionskraft verursacht, die von den Mikroperlen in zytoskeletthaltigen Zellen ausgeübt wird. Die Kalibrierkurve der quantitativen Bildanalyse, die durch die quantitative AFM-Kraftverschiebungsbeziehung bereitgestellt wird.Basierend auf dieser Beziehung wurde die aufgebrachte Kraft der Perlen geschätzt. Die Kernverformung und die YES-assoziierte Proteintranslokation wurden bei Anwendung oder Freisetzung der magnetischen Kraft beobachtet. Die Intensitätsänderungen des YES-assoziierten Proteins im grünen Kanal und keine Änderung der Kernfärbung im roten Kanal bestätigten, dass die durch die Magnetkraft induzierte Kernverformung durch die YES-assoziierte Proteintranslokation ausgelöst wurde.Die Quantifizierung der Nettoänderung des YES-assoziierten Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnisses innerhalb von zwei Gruppen bestätigte, dass die Magnetkraft, die auf die Mikroperlen innerhalb des Zytoplasmas ausgeübt wird, die YES-assoziierte Proteintranslokation induzierte und das YES-assoziierte Proteinkern-zu-Zytoplasma-Verhältnis veränderte. Bevor Sie Kraft und Bildgebung anwenden, stellen Sie sicher, dass die Zellen die magnetischen Mikroperlen verinnerlicht haben und sich die Perlen innerhalb der Zellgrenze befinden.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

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Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

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Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...