Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology at JoVE.com

פרויקט זה ממומן על ידי חבילת הסטארט-אפ של פרס UF Gatorade (X. T.), פרס הפיילוט של UFHCC (X. T. וד"ר דיטמר סימן), קרן הזרעים של UF Opportunity (X. T.), ותוכנית החוקרים של אוניברסיטת UFHCC (H. Y. Wang). אנו מעריכים מאוד את הדיונים האינטלקטואליים עם ד"ר ג'ונתן ליכט (UFHCC), ד"ר רולף רן (UFHCC), ד"ר כריסטופר וולפה (UFHCC), ד"ר בלנקה שארמה (BME), ד"ר מארק שפלאק (MAE ו- ECE), ד"ר דניאל פריס (BME), ד"ר מליסה סרנטינורנונט (MAE), ד"ר אשוק קומאר (MAE), ד"ר בנג'מין קסלובסקי (BME), ד"ר ברנט גילה (RSC), ד"ר פיליפ פנג (ECE), ד"ר גרגורי א. הודלה (BME), ד"ר סטיבן גיביזאני (OSSM), ד"ר יניסל קרוז-אלמיידה (CDBS), ד"ר רוג'ר פילינגים (CD-BS), ד"ר רוברט קאודל (OMS), ד"ר ג'ון נויברט (DN-OR), ד"ר ג'סטין היליארד (נוירוכירורגיה), ד"ר טיאן הא (אוניברסיטת הרווארד), ד"ר יוהואה טאן (האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג), ד"ר ג'סי L-S Au (המכון לפרמקולוגיה של מערכות כמותיות), ד"ר דיוויד האן (אוניברסיטת אריזונה), וצוות התמיכה של ניקון (ד"ר חוזה סראנו-ולז, לארי קורדון וג'ון אקמן). אנו אסירי תודה על התמיכה האפקטיבית של כל חברי מעבדות המחקר של טאנג, יאמאגוצ'י, שארמה, או, סימן וגואן וכל חברי הצוות של מחלקת UF MAE.

1. תחזוקה של תאי B2B מהונדסים בקריספר/Cas9
<ol><li>תרבית תאי B2B בבקבוק T25 עם RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>שמור על תאי B2B באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.</li>
	<li>תת-תרבית של תאי B2B כאשר המפגש מגיע ל-70% עד 80%.</li>
	<li>אחסן את קו התאים B2B בתרבית RPMI...

הפנמה של מיקרובים מגנטיים (סעיף 2.2) היא קריטית מאחר שמיקרובים חוץ-תאיים אינם יכולים להפעיל כוח ישירות על הגרעין. הפעלת כוח והדמיה (סעיף 5.3) הם שלבים קריטיים בניסוי זה, והכוח הדרוש כדי לעוות את הגרעין ולגרום לתוצאות ביולוגיות משמעותיות עשוי להיות תלוי בדגימה. ניתן להגדיל עוד יותר את עוצמת הכו...

מחקר זה נועד לפתח וליישם טכניקה חדשה להבהרת גרעין המכנוביולוגיה על ידי שילוב של המפעילים מגנטיים המפעילים כוח מכני ישירות על גרעין התא ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית המדמה בו זמנית את השינויים התת-תאיים המבניים והתפקודיים. התאים חשים אותות ביופיזיים חוץ-תאיים, כולל קשיחות רקמות 1,2,3,4, לחץ נוזל בין-תאי ולחץ גזירה 5,6,7, טופולוגיה/גיאומטריה של פני השטח 8,9,10,11,12, ולחץ מתח/דחיסה13,14, 15,16. אותות ביופיזיים מומרים לאותות ביוכימיים ומעוררים שינויים פוטנציאליים במורד הזרם של ביטוי גנים והתנהגויות תאים - תהליך המכונה מכנינוטרנסדוקציה 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . כדי לחקור תהליכי מכני-טרנסדוקציה, פותחו מספר עצום של טכניקות להפעלת כוח מכני על התאים, כגון מיקרוסקופיה של כוח אטומי28, מכשיר מתיחה של תאים29, חיישן כוח ביו-MEMS (מערכות מיקרו-אלקטרו-מכניות) 15,30,31, ריאולוגיה גזירה 32 ומערכת ראייה סטריאופונית 33 . סקירה שפורסמה לאחרונה מסכמת את הגישות להפעלת רמזים מכניים חוץ-תאיים ולהפריע למכניוסנסינג34. נכון להיום, רוב השיטות הללו מפעילות כוח על קרום הפלזמה של התא, והתאים מקבלים ישירות את האותות הביופיזיים החוץ-תאיים האלה באמצעות קולטני ממברנה כגון אינטגרין, קדהרין, תעלות יונים וקולטנים מצומדים לחלבון G. לאחר מכן, הם מעבירים את האות לשלד התוך תאי ולגרעין. לדוגמה, באמצעות טרנסלוקציה של חלבון הקשור כן (YAP) כאינדיקטור לחישת מכנו, תאים נראים חשים את האותות המכניים של נוקשות המצע והמתח החוץ-תאי מקרום התא ומעבירים אותם דרך השלד הציטוסקולרי לתוך הגרעין כדי לגרום לטרנסלוקציה של ציטופלסמה לגרעין YAP28,35.
עדויות עדכניות מצביעות על כך שגרעין התא עצמו הוא חיישן מכנו עצמאי 8,36,37. זה הוכח על ידי ניסויים שבוצעו על הגרעין המבודד שנקטף מתאים, שם התגלה כי גרעינים באופן אדפטיבי לשנות את הנוקשות שלהם בתגובה לכוח המכני המופעל ישירות עליהם36. בתנאים פיזיולוגיים רבים, גרעינים הן בתאים סרטניים והן בתאים בריאים חשים אותות ביופיזיקליים חוץ-תאיים ומשנים את תכונותיהם המכניות ואת מכלוליהם38,39,40. לדוגמה, עם האקסטרווזה, הנוקשות הגרעינית של תאי הגידול פוחתת ושומרת על רכות במשך יותר מ-24 שעות38. במהלך נדידה דרך חלל ביניים סגור, גרעיני תאי הגידול מאבדים לעתים קרובות ומשחזרים את שלמותם המבנית39. עם זאת, האופן שבו הגרעין חש את האות הביופיזי אינו ידוע, אם כי נמצאו מעורבים מספר חלבונים בעלי מעטפת גרעינית ומשפחות של חלבונים, כגון Lamin A/C ומקשר של קומפלקס נוקלאוסקלטון וציטוסקלטון (LINC)38,41. לפיכך, שיטות לא פולשניות חדשות שיכולות להפעיל כוח ישירות על הגרעין ינתקו את ההשפעה של העברת כוח מממברנת התא-פלזמה ושלד הציטוסקלטון, ויסייעו להבהיר את המנגנונים המולקולריים שלא היו נגישים בעבר של חישת מכנו-חישה גרעינית.
מחקר שהשתמש בפינצטה אופטית כדי לתמרן אברונים42 ומיקרובים שהוזרקו לתאים43 הראה את היכולת הטכנולוגית של הפעלת כוח ישירות על הגרעין. עם זאת, לטכניקת הפינצטה האופטית יש מספר מגבלות: (1) פינצטות אופטיות בעלות תפוקה נמוכה לעיתים קרובות מתמרנות רק תא אחד או מיקרובאד אחד בכל פעם; ו-(2) פוטו-דפורמציה פוטנציאלית ועיוות טמפרטורה של הגרעין דורשת עשרות pN36, ועוצמת הלייזר הנדרשת המתאימה היא כ-10 mW ל-pN44,45. עוצמת לייזר כזו מספיקה כדי לגרום לפוטו-נזק בתאים ולהפריע לתפקודי התאים במהלך הניסוי46.
כוח מגנטי המופעל באמצעות מיקרובים בתוך תאים חיים מראה את הפוטנציאל להפעיל כוח ישירות על הגרעין ומתגבר על המגבלות של פינצטה אופטית. ברגע שמיקרובים מועברים לתוך הציטופלסמה, שדה מגנטי יכול להפעיל כוח מגנטי על מספר מיקרובים בו זמנית באופן בעל תפוקה גבוהה. השדה המגנטי אינו משפיע על תפקודי התא47, אלא מייצר כוח מ-pN ל-nN, וזה מספיק כדי לגרום לעיוות גרעיני 36,48,49. עד כה, מניפולציה של חיידקים מגנטיים יושמה על קרום פלזמה תאית48, בתוך הציטופלסמה50, על F-actin51, בתוך הגרעין47, ועל הגרעין המבודד36. עם זאת, מניפולציה מגנטית של מיקרובים מעולם לא שימשה להפעלת כוח מכני ישיר על מעטפת הגרעין כדי לחקור מכנוטרנסדוקציה בגרעין.
במאמר זה פותחה טכניקה פשוטה להעברה לא פולשנית של מיקרובים מגנטיים לתוך הציטופלסמה, ושימוש במיקרובים האלה כדי להפעיל כוח מכני על הגרעין (איור 1). כאן, קווי תאי B2B אנושיים רגילים מהונדסים על ידי CRISPR/Cas9 המבטאים באופן אנדוגני mNeonGreen21-10/11-מתויג YAP משמשים לאימות השיטה. YAP הוא חלבון רגיש למכנו, והטרנסלוקציה של YAP מווסתת על ידי חישת מכאנו גרעינית14,28. גישת ה-knock-in המווסתת קריספר/Cas9 נבחרה כדי לתייג YAP אנדוגני עם חלבון פלואורסצנטי (FP) mNeonGreen21-10/11. למרות שידוע שלעריכת קריספר יש יעילות חלקית ואפקט מחוץ למטרה, הפרוטוקולים בפרסומים קודמים שילבו מיון פלואורסצנטי כדי לבחור להכנסת מסגרת קריאה פתוחה נכונה52,53,54. עם שכבת בחירה נוספת זו, לא נצפה אירוע תיוג מחוץ למטרה ב-20+ שורות תאים שנוצרו בעברב-52,53,54,55. זהו מבנה חלבון פלואורסצנטי מפוצל, אך באופן עקרוני, כל תג פלואורסצנטי הניתן לביטוי יכול להיות שמיש. גישת תיוג זו עדיפה על שיטות טרנסגניות או נוגדנים. ראשית, בניגוד לביטוי הטרנסגני, החלבון המתויג שומר על מינון גן של עותק יחיד ומתבטא בהקשר הפיזיולוגי של רשת הוויסות של הגנים המקומיים, תוך הגבלת סטיות בריכוז החלבון, לוקליזציה ואינטראקציה. שיטת התיוג ששימשה במחקר זה משיגה תפוקה ויעילות גבוהות יותר בסדר גודל מאשר תיוג FP מלא. הוא גם נמנע מאתגרים הקשורים לאימונופלואורסצנציה בשל ממצאי קיבוע והזמינות המוגבלת של נוגדנים איכותיים וספציפיים במיוחד. שנית, הגישה שבה נעשה שימוש במאמר זה עושה מינימום הפרעה לפיזיולוגיה של התא ומאפשרת גילוי בזמן אמת של כל ה-YAPs האנדוגניים באופן אותנטי. לעומת זאת, שיטות טרנסגניות נפוצות אחרות מובילות לעתים קרובות לביטוי יתר של YAP. ההפצה המלאכותית הנובעת מכך עלולה לגרום לציטוטוקסיות ולהשפיע על חישת מכאנו של תאים56,57,58.
מחקר זה מציג פרוטוקול להפעלת כוח ישירות על הגרעין באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים. לסיכום, הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים כיצד (1) להעביר מיקרובים מגנטיים לתוך התא כשהם מחוץ לגרעין, (2) לתמרן את המיקרובים כדי להפעיל כוח מגנטי על הגרעין, (3) לבצע הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של התאים במהלך מניפולציה, ו-(4) לנתח באופן כמותי את יחס הגרעין/ציטופלסמה (N/C) של YAP לאורך כל תהליך יישום הכוח. התוצאות מצביעות על כך ש-(1) באמצעות אנדוציטוזה, מיקרובים מגנטיים יכולים להיות מועברים באופן לא פולשני לציטופלסמה של תאי B2B תוך 7 שעות (איור 2 ואיור 3); ו-(2) כוח מגנטי מכמת המופעל ישירות על הגרעין (איור 4, איור 5 ואיור 6) לבדו יכול לגרום לשינויים מגוונים ביחס YAP N/C בתאי B2B מהונדסים של CRISPR/Cas9 (איור 7 ואיור 8).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

שאלה בסיסית במכנוביולוגיה היא כיצד תאים חיים חשים גירויים מכניים חוץ-תאיים בהקשר של פיזיולוגיה ופתולוגיה של התא. תחושת המכנו התאית של גירויים מכניים חוץ-תאיים היא ככל הנראה דרך קולטני הממברנה, קומפלקס החלבונים הקשורים ושלד הציטוסקלטון. ההתקדמות האחרונה במכנוביולוגיה מדגימה כי גרעין התא בציטופלסמה עצמה יכול לחוש באופן עצמאי גירויים מכניים בו זמנית. עם זאת, הבנה מכניסטית של האופן שבו גרעין התא חש, מתמר ומגיב לגירויים מכניים לוקה בחסר, בעיקר בגלל האתגרים הטכניים בגישה ובכימות מכניקת הגרעין על ידי כלים קונבנציונליים. מאמר זה מתאר את התכנון, הייצור והיישום של מפעיל כוח מגנטי חדש המפעיל גירויים מכניים תלת-ממדיים מדויקים ולא פולשניים כדי לעוות ישירות את גרעין התא. באמצעות שימוש בתאים מהונדסים של CRISPR/Cas9, מחקר זה מדגים כי כלי זה, בשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית ברזולוציה גבוהה, מאפשר את גילוי הדינמיקה בזמן אמת של חלבון רגיש למכנו (YAP) בתאים בודדים כפונקציה של עיוות גרעין. לשיטה פשוטה זו יש פוטנציאל לגשר על הפער הטכנולוגי הנוכחי בקהילת המכנוביולוגיה ולספק תשובות לפער הידע הקיים ביחס בין גרעין המכנוטרנסדוקציה לתפקוד התא.

תכנון מכשיר הנעת מגנט ויישום כוח מגנטי כדי להפעיל כוח על הגרעין דרך המיקרובים המגנטיים, תוכנן ונבנה מכשיר הנע מגנט כדי לשלוט במיקום המרחבי של המגנט. המכשיר הנע באמצעות מגנט מכיל מסגרת מרכזית, שלוש ידיות ומסילות להזזת המגנט המחובר בכיוונים x, y ו-z באופן עצמאי ברזולוציה המרחבית של ...

Watch this Scientific Journal Video about Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology at JoVE.com

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

מחקר זה מציג פרוטוקול חדש להפעלת כוח מכני ישירות על גרעין התא באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים.

שילוב של מפעיל כוח מגנטי תלת-ממדי והדמיה פלואורסצנטית רב-תפקודית לחקר גרעין המכנוביולוגיה

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

בשיטה זו, הכוח מוחל ישירות על הגרעין. פעולה זו מנתקת את אפקט העברת הכוח מממברנת הפלזמה התאית ומהשלד הציטוסקולרי, וחושפת את המנגנונים המולקולריים של מכניוסנסינג גרעיני. הכוח מופעל בתוך התאים החיים בצורה לא פולשנית.בהשוואה לפינצטה אופטית, השדה המגנטי והכוח המגנטי אינם משפיעים על תפקודי התא ובעלי תפוקה גבוהה יותר. התחילו לגדל את התאים עם מיקרובים מגנטיים על ידי שקילה של 0.2 גרם של מיקרובי ברזל קרבוניל בקוטר ממוצע של שבעה מיקרומטרים. להשעות את החיידקים במדיום תרבית RPMI 1640 מיליליטר אחד באמצעות פיפטה.לאחר מכן קחו את צלחת הפטרי עם תאי B2B לארון הביו-בטיחות והוסיפו במהירות 200 מיקרוליטרים של המדיום המכיל מיקרובים לצלחת פטרי. שים את צלחת פטרי באינקובטור עד שהמיקרובים מופנמים על ידי התאים. פתח את המיקרוסקופ ההפוך ובאמצעות הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית, קבע את הזמן האופטימלי להפנמת קווי התאים כל שש שעות על ידי הדמיה של גבול המיקרוב, הגרעין והתא.המיקרובים המופנמים יהיו נוכחים בגבולות התא. עבור יישום כוח קטן והדמיית תאים חיים, פתח את יישום התוכנה Elements. כדי להגדיר את התצורה של חיפוש מגנטי, לחץ על הלחצן אחד מעל שניים כדי להגדיר את מהירות הסריקה למסגרת אחת לשתי שניות.הגדר את גודל חור הסיכה ל-1.2 יחידה אוורירית. בדוק רק את ערוץ FITC והגדר את PMT HV כ- 70, היסט כאפס, עוצמת לייזר כ- 10. כדי להגדיר את גרעין YAP המגנטי של התצורה, הגדר את מהירות הסריקה למסגרת אחת לארבע שניות על-ידי לחיצה על לחצן אחד מעל ארבע.לאחר מכן לחץ על כפתור 1.2 Airy unit כדי להגדיר את גודל חור הסיכה ליחידה 1.2 Airy ובדוק את ערוץ FITC. הגדר את PMT HV כ- 70, היסט כאפס, עוצמת לייזר כ- 10. להדמיית גבול הגרעין ועוצמת הכתם הגרעיני, בדקו את תעלת ציאנין 5.אל תלחץ על לחצן 1.2 Airy unit והגדר את PMT HV ל-70, היסט לאפס ועוצמת הלייזר ל-10. גודל חור הסיכה יותאם להדמיית חלבונים תלת-ממדית הקשורה ל-YES. לאחר מכן, הפעל את DIA באמצעות אלמנטים.פתח תצוגת סיבוב, השתמש בשדה בהיר והתאם את המיקוד של האובייקט כדי לקבל תמונה ברורה של תאים במיקוד. השתמש במטרה של פי 10 כדי למצוא תאים בודדים מרובים מתאימים בשלושה תנאים, כגון תא עם מיקרוב יחיד בפנים, עם מיקרובים מרובים בפנים, וללא מיקרובים בפנים. לאחר מכן עבור למטרה 40X ותן שם למיקום זה עם מספר המיקום המתאים.פתח את Elements, לחץ על חיפוש מגנטי, הסר אינטרלוק, לאחר מכן סרוק כרטיסיות, ולאחר מכן בחר את הלחצנים העליונים והתחתונים כדי להתאים את מיקום Z של מישור המוקד לקביעת הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z של התאים שנבחרו. הפסק את הסריקה על-ידי לחיצה נוספת על סרוק. עבור לתצורת גרעין YAP מגנטי והגדר את שם הקובץ כ- before_small_force.nd2.לחץ על כפתור ההפעלה עם ערימת Z המוקלטת. עבור לנתיב האור הימני והפעל את DIA. פתח תצוגת סיבוב ולחץ על כפתור ההקלטה.הזז את המגנט ל-46 מילימטרים מעל תחתית צלחת פטרי על ידי סיבוב הידית של המכשיר הנע מגנט. שמור ובדוק את הסרטון כדי לאשר את תזוזת החיידקים המושרה על ידי כוח מגנטי. חזור על הליך הסריקה על-ידי הגדרת שם הקובץ כ- after_small_force.nd2.לאחר מכן, עבור לנתיב האור הימני, הפעל את DIA ופתח תצוגת סיבוב לפני שתלחץ על כפתור ההקלטה. סובב את ידית המכשיר הנע מגנט עד 120 מילימטרים מעל תחתית צלחת פטרי ושמור רצף תמונות או סרטון brightfield. חזור על השלבים לסריקה על-ידי הגדרת שם הקובץ ל- before_large_force.nd2.המיקרובים אינם יכולים לפלוט פלואורסצנטיות תחת עירור לייזר בערוץ FITC או בערוץ 5 של ציאנין. לפיכך, המיקרובים המופנמים זוהו על ידי החלול הכהה הממוקם בהדמיה הקונפוקלית של פלואורסצנציה של חלבון וגרעין הקשורים ל-YES. מעגליות גרעינית לא הראתה הבדל משמעותי בין תאי בקרה לתאים עם הפנמת מיקרובים.גם היחס בין גרעין תא חלבון לציטופלסמה הקשור ל-YES של תאי בקרה שגודלו בתרבית עם מיקרובים אך ללא הפנמה ותאים עם הפנמת מיקרובים לא הראה הבדל משמעותי. דפורמציית הגרעין ודה-פילמור של אקטין נגרמו על ידי כוח הדחיסה שהפעילו החיידקים בתאים המכילים שלד ציטוסקולרי. עקומת כיול ניתוח ההדמיה הכמותי המסופקת על ידי יחסי תזוזת כוח AFM הכמותיים.בהתבסס על מערכת יחסים זו, הוערך כוח החרוזים שהופעלו. דפורמציית הגרעין וטרנסלוקציה של חלבונים הקשורים ל-YES נצפו ביישום או בשחרור הכוח המגנטי. שינויי העוצמה בחלבון הקשור ל-YES בתעלה הירוקה וללא שינוי בכתם הגרעין בתעלה האדומה אישרו כי העיוות הגרעיני המושרה בכוח המגנטי נגרם על ידי טרנסלוקציית החלבון הקשורה ל-YES.כימות השינוי נטו של יחס גרעין החלבון הקשור ל-YES בתוך שתי קבוצות אישר כי הכוח המגנטי המופעל על המיקרובים בתוך הציטופלסמה גרם לטרנסלוקציה של החלבון הקשור ל-YES ושינה את יחס גרעין החלבון הקשור ל-YES. לפני הפעלת כוח והדמיה, ודא שהתאים הפנימו את החרוזים המגנטיים והחרוזים נמצאים בתוך גבולות התא.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...