Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
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このプロジェクトは、UFゲータレードアワードスタートアップパッケージ(X.T.)、UFHCCパイロットアワード(X.T.およびディートマールシーマン博士)、UFオポチュニティシードファンド(X.T.)、およびUFHCC大学奨学生プログラム(HY.ワン)によって資金提供されています。ジョナサン・リヒト博士(UFHCC)、ロルフ・レネ博士(UFHCC)、クリストファー・ヴァルプ博士(UFHCC)、ブランカ・シャルマ博士(BME)、マーク・シェプラク博士(MAE&ECE)、ダニエル・フェリス博士(BME)、マリサ・サルンティノラノン博士(MAE)、アショク・クマール博士(MAE)、ベンジャミン・ケセロウスキー博士(BME)、ブレント・ギラ博士(RSC)、フィリップ・フェン博士(ECE)、 グレゴリー・A・フダラ博士(BME)、スティーブン・ギヴィッツァーニ博士(OSSM)、エニセル・クルス・アルメイダ博士(CDBS)、ロジャー・フィリンギム博士(CD-BS)、ロバート・コードル博士(OMS)、ジョン・ノイバート博士(DN-OR)、ジャスティン・ヒリアード博士(脳神経外科)、天和博士(ハーバード大学)、ヨウフア・タン博士(香港理工大学)、ジェシー・L-S Au博士(定量システム薬理学研究所)、デビッド・ハーン博士(アリゾナ大学) ニコンの支援チーム(ホセ・セラーノ・ベレス博士、ラリー・コードン博士、ジョン・エクマン博士)。唐、山口、シャルマ、アウ、シーマン、グアンの研究所のすべてのメンバーとUF MAE部門のすべてのスタッフからの効果的なサポートに深く感謝しています。

1. CRISPR/Cas9遺伝子改変B2B細胞のメンテナンス
<ol><li>10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640を含むT25フラスコでB2B細胞を培養します。</li>
	<li>B2B細胞を加湿インキュベーター内で5%CO2を含む37°Cに維持する。</li>
	<li>コンフルエントが70%〜80%に達したときにB2B細胞を継代培養する。</li>
	<li>B2B細胞株を10%(v/v)DMSOを含むRPMI-1640培養培地の-80°C冷凍?...

細胞外マイクロビーズは核に直接力を加えることができないため、磁気マイクロビーズの内在化(セクション2.2)は重要です。力の適用とイメージング(セクション5.3)は、この実験の重要なステップであり、核を変形させて意味のある生物学的結果を誘発するために必要な力は、サンプルに依存する可能性があります。この実験の力の大きさ(0.8 nNと1.4 nN)をさらに大きくして、感度の低い細胞で?...

本研究では、細胞核に直接機械的な力を加える磁気アクチュエータと、細胞内構造変化と機能変化を同時に撮像する共焦点蛍光顕微鏡を組み合わせることで、核メカノバイオロジーを解明する新しい技術を開発し、応用することを目的としています。細胞は、組織の硬さ1,2,3,4、間質液圧およびせん断応力5,6,7、表面トポロジー/形状8,9,10,11,12、および引張/圧縮応力13,14を含む細胞外生物物理学的シグナルを感知します。15,16。生物物理学的シグナルは生化学的シグナルに変換され、遺伝子発現と細胞挙動の潜在的な下流変化を引き起こします-メカノトランスダクションとして知られるプロセス17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.メカノトランスダクションプロセスを研究するために、原子間力顕微鏡28、細胞伸張装置29、バイオMEMS(微小電気機械システム)力センサ15、30、31、せん断レオロジー32、ステレオビジョンシステム33など、細胞に機械的力を加えるための無数の技術が開発されています。.最近のレビューでは、細胞外の機械的手がかりを適用し、メカノセンシングを妨害するアプローチを要約しています34。現在まで、これらの方法のほとんどは細胞原形質膜に力を加えており、細胞はインテグリン、カドヘリン、イオンチャネル、Gタンパク質共役型受容体などの膜受容体を介してこれらの細胞外生物物理学的シグナルを直接受信しています。続いて、それらは細胞内の細胞骨格および核にシグナルを伝達する。例えば、メカノセンシングの指標としてyes随伴タンパク質(YAP)転座を用いると、細胞は細胞膜からの基質の硬さおよび細胞外張力の機械的シグナルを感知し、それらを細胞骨格を介して核に伝達し、YAP細胞質から核への転座を誘導することが示されている28,35。
最近の証拠は、細胞核自体が独立したメカノセンサーであることを示唆しています8,36,37。これは、細胞から採取された単離された核で行われた実験によって証明され、そこでは、核がそれらに直接加えられた機械的な力に応答してそれらの剛性を適応的に変化させることが明らかになった36。多くの生理学的状態の間、腫瘍細胞および健康な細胞の両方における核は、細胞外生物物理学的シグナルを感知し、それらの機械的特性および集合体を変化させる38,39,40。例えば、血管外漏出時に、腫瘍細胞の核硬直は減少し、24時間38時間にわたって柔らかさを維持する。限られた間質空間を通る移動中に、腫瘍細胞の核はしばしばその構造的完全性を失い、回復する39。しかし、核が生物物理学的シグナルを感知する方法は不明ですが、ラミンA / Cや核骨格と細胞骨格のリンカー(LINC)複合体など、いくつかの核エンベロープタンパク質とタンパク質ファミリーが関与していることがわかっています38,41。したがって、核に直接力を加えることができる新しい非侵襲的方法は、細胞原形質膜と細胞骨格からの力伝達の影響を切り離し、これまでアクセスできなかった核メカノセンシングの分子メカニズムの解明に役立ちます。
光ピンセットを用いて細胞小器官42を操作し、細胞43に注入したマイクロビーズを用いた研究は、核に直接力を加える技術力を示した。しかしながら、光ピンセット技術にはいくつかの制限がある:(1)低スループット光ピンセットは、しばしば一度に1つの細胞またはマイクロビーズしか操作しない。(2)核の潜在的な光損傷および温度アーチファクト変形には数十のpN36が必要であり、対応する必要なレーザー出力はpN44,45あたり約10mWです。このようなレーザー強度は、実験46の間に細胞における光損傷を引き起こし、細胞機能を混乱させるのに十分である。
生細胞内のマイクロビーズを介して加えられる磁力は、核に直接力を加える可能性を示し、光ピンセットの限界を克服します。マイクロビーズが細胞質に送達されると、磁場は複数のマイクロビーズに同時にハイスループットな方法で磁力を及ぼすことができます。磁場は細胞機能47に影響を与えないが、pNからnNまでの力を生成し、これは核変形を誘発するのに十分である36,48,49。現在までに、磁気マイクロビーズの操作は、細胞原形質膜48、細胞質50の内部、F-アクチン51、核47の内部、および単離された核36に適用されてきた。しかし、マイクロビーズの磁気操作は、核内のメカノトランスダクションを研究するために核エンベロープに直接的な機械的力を加えるために使用されたことはありません。
本論文では、磁性マイクロビーズを細胞質に非侵襲的に送達し、このマイクロビーズを使用して核に機械的な力を加える簡単な技術を開発しました(図1)。ここでは、mNeonGreen21-10/11タグ付きYAPを内因的に発現するCRISPR/Cas9操作されたヒト正常B2B細胞株を使用して、この方法を検証します。YAPはメカノ感受性タンパク質であり、YAPの転座は核メカノセンシングによって制御されています14,28。CRISPR/Cas9制御ノックインアプローチは、内因性YAPに蛍光タンパク質(FP)mNeonGreen21-10/11をタグ付けするために選択されました。CRISPR編集は不完全な効率とオフターゲット効果を有することが知られているが、以前の出版物のプロトコルは、正しいオープンリーディングフレーム挿入のために選択するために蛍光ソーティングを統合した52、53、54。この追加の選択層により、以前に生成された20+細胞株においてオフターゲットタグ付け事象は観察されなかった52,53,54,55。これはスプリット蛍光タンパク質構築物ですが、原理的には、任意の発現可能な蛍光タグを使用できます。この標識アプローチは、導入遺伝子または抗体法よりも優れています。第一に、導入遺伝子発現とは異なり、タグ付きタンパク質は単コピー遺伝子投与量を維持し、天然遺伝子調節ネットワークの生理学的状況で発現し、タンパク質濃度、局在、および相互作用の偏差を制限する。この研究で使用されたタグ付け方法は、完全なFPタグ付けよりも桁違いに高いスループットと効率を達成します。また、固定アーチファクトや高品質で特異性の高い抗体の限られた入手による免疫蛍光に関連する課題を回避します。第二に、この論文で使用されているアプローチは、細胞生理学への摂動を最小限に抑え、すべての内因性YAPのリアルタイム啓示を可能にします。対照的に、他の一般的な導入遺伝子法は、しばしばYAPの過剰発現をもたらす。結果として生じる人工的な分布は、潜在的に細胞毒性を引き起こし、細胞のメカノセンシングに影響を与える可能性があります56、57、58。
この研究は、細胞質に送達された磁気マイクロビーズを介して核に直接力を加え、同時に生細胞蛍光イメージングを行うためのプロトコルを提示します。要約すると、ここで提示されたプロトコルは、(1)核の外側で磁気マイクロビーズを細胞内に送達する方法、(2)マイクロビーズを操作して核に磁力を加える方法、(3)操作中に細胞の共焦点蛍光イメージングを実行する方法、および(4)力を加えるプロセス全体を通してYAP核/細胞質(N / C)比を定量的に分析する方法を示しています。結果は、(1)エンドサイトーシスを介して、磁気マイクロビーズが7時間以内にB2B細胞の細胞質に非侵襲的に送達できることを示唆しています(図2および図3)。(2)核に直接加えられた定量化された磁力(図4、図5、および図6)だけで、CRISPR/Cas9操作B2B細胞におけるYAP N / C比の多様な変化を引き起こす可能性があります(図7および図8)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

メカノバイオロジーにおける基本的な問題は、細胞生理学と病理学の文脈で、生細胞が細胞外の機械的刺激をどのように感知するかということです。細胞外力学的刺激の細胞メカノ感覚は、膜受容体、関連するタンパク質複合体、および細胞骨格を介して行われると考えられています。メカノバイオロジーの最近の進歩は、細胞質自体の細胞核が独立して機械的刺激を同時に感知できることを示しています。しかし、細胞核が機械的刺激をどのように感知し、形質導入し、応答するかについての機構的理解は、主に従来のツールによる核力学へのアクセスと定量化における技術的課題のために不足しています。この論文では、正確で非侵襲的な3D機械的刺激を適用して細胞核を直接変形させる新しい磁力アクチュエータの設計、製造、および実装について説明します。CRISPR/Cas9で改変された細胞を用いて、このツールと高解像度の共焦点蛍光イメージングを組み合わせることで、単一細胞におけるメカノ感受性Yes随伴タンパク質(YAP)のリアルタイムダイナミクスを核変形の関数として明らかにすることができることを実証する。この簡単な方法は、メカノバイオロジーコミュニティにおける現在の技術ギャップを埋め、核のメカノトランスダクションと細胞機能との関係に存在する知識ギャップに対する答えを提供する可能性を秘めています。

磁石移動装置の設計と磁力の応用 磁気マイクロビーズを介して原子核に力を加えるために、磁石の空間位置を制御するために磁石移動装置が設計および構築されました。磁石移動装置には、中央フレーム、3つのノブ、およびレールが含まれており、取り付けられた磁石をサイクルあたり1.59mmの空間分解能でx、y、z方向に独立して移動させます(図1A)。磁?...

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Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。

3D磁力アクチュエータと多機能蛍光イメージングを組み合わせて核メカノバイオロジーを研究

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

この方法では、力は核に直接加えられます。これにより、細胞原形質膜と細胞骨格からの力伝達効果が切り離され、核メカノセンシングの分子メカニズムが明らかになります。力は非侵襲的な方法で生細胞内に加えられます。光ピンセットと比較して、磁場と磁力は細胞の機能に影響を与えず、より高いスループットを持っています。平均直径7マイクロメートルのカルボニル鉄マイクロビーズを0.2グラム秤量して、磁気マイクロビーズで細胞の培養を開始します。ピペットを使用して、マイクロビーズを1ミリリットルのRPMI 1640培養培地に懸濁します。次に、B2B細胞を含むペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに入れ、マイクロビーズを含む培地200マイクロリットルをペトリ皿にすばやく追加します。マイクロビーズが細胞によって内在化されるまで、ペトリ皿をインキュベーターに入れます。倒立顕微鏡を開き、共焦点蛍光イメージングを使用して、マイクロビーズ、核、および細胞境界を視覚化することにより、6時間ごとに細胞株の内在化に最適な時間を決定します。内部化されたマイクロビーズは細胞境界内に存在します。小荷重アプリケーションと生細胞イメージングの場合は、ソフトウェアアプリケーションElementsを開きます。構成磁気検索を定義するには、1 over 2 ボタンをクリックして、スキャン速度を 2 秒ごとに 1 フレームに設定します。ピンホールサイズを1.2エアリー単位に設定します。FITCチャンネルのみを確認し、PMT HVを70、オフセットをゼロ、レーザー強度を10に設定します。構成磁気YAP核を定義するには、1つ上の4つのボタンをクリックして、スキャン速度を4秒ごとに1フレームに設定します。次に、1.2エアリーユニットボタンをクリックしてピンホールサイズを1.2エアリーユニットに設定し、FITCチャネルを確認します。PMT HVを70、オフセットをゼロ、レーザー強度を10に設定します。核境界と核染色強度をイメージングするには、シアニン5チャネルを確認してください。1.2エアリーユニットボタンをクリックして、PMT HVを70、オフセットをゼロ、レーザー強度を10に設定しないでください。ピンホールサイズは、3次元YES関連タンパク質イメージング用に最適化されます。次に、要素を介してDIAをオンにします。スピンビューを開き、明視野を使用してオブジェクトの焦点を調整し、セルの焦点が合っている鮮明な画像を取得します。10倍の対物レンズを使用して、内部に単一のマイクロビーズがあるセル、内部に複数のマイクロビーズがあるセル、内部にマイクロビーズがないセルなど、3つの条件で適切な複数の単一セルを見つけます。次に、40X対物レンズに切り替えて、この位置に適切な位置番号を付けます。要素を開き、磁気検索をクリックし、インターロックを解除してからタブをスキャンし、上ボタンと下ボタンを選択して焦点面のZ位置を調整し、選択したセルのZスタックの下限と上限を設定します。もう一度 [スキャン] をクリックしてスキャンを停止します。磁気 YAP 核構成に切り替え、ファイル名を before_small_force.nd2 に設定します。記録されたZスタックの実行ボタンをクリックします。正しい光路に切り替えてDIAをオンにします。 スピンビューを開き、録音ボタンをクリックします。磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から46ミリメートル上に移動します。ビデオを保存してチェックし、磁力によって誘発されるマイクロビーズの変位を確認します。ファイル名をafter_small_force.nd2に設定して、スキャン手順を繰り返します。次に、正しい光路に切り替え、DIAをオンにしてスピンビューを開き、録音ボタンをクリックします。磁石移動装置のノブをペトリ皿の底から最大120ミリメートル上に回転させ、明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。ファイル名を before_large_force.nd2 に設定して、スキャンの手順を繰り返します。マイクロビーズは、FITCまたはシアニン5チャネルのレーザー励起下で蛍光を発することはできません。したがって、インターナライズされたマイクロビーズは、YES関連タンパク質および核の蛍光の共焦点イメージングに位置する暗くぼみによって同定された。核の円形度は、コントロール細胞とマイクロビーズのインターナリゼーションを有する細胞との間に有意差を示さなかった。マイクロビーズと共培養したがインターナリゼーションを行わなかったコントロール細胞とマイクロビーズインターナリゼーションを行った細胞のYES関連タンパク質細胞核と細胞質比も有意差を示さなかった。アクチンの核の変形と脱重合は、細胞骨格含有細胞のマイクロビーズによって加えられた圧縮力によって引き起こされました。定量的AFM力変位関係により提供される定量的イメージング解析検量線。この関係に基づいて、ビーズの加わる力を推定した。核の変形とYES関連タンパク質の転座は、磁力の適用または解放で観察されました。緑チャネルではYES関連タンパク質の強度変化、赤チャネルでは核染色に変化がないことから、YES関連タンパク質の転座による磁力誘発核変形が引き起こされることが確認された。2群内のYES関連タンパク質核対細胞質比の正味変化を定量化した結果、細胞質内のマイクロビーズに加えられた磁力がYES関連タンパク質転座を誘導し、YES関連タンパク質核と細胞質比を変化させることが確認された。力を加えてイメージングする前に、細胞が磁気マイクロビーズを内在化させ、ビーズが細胞境界内にあることを確認してください。

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