Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
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이 프로젝트는 UF Gatorade Award Start-up Package (XT), UFHCC Pilot Award (XT 및 Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (XT) 및 UFHCC University Scholars Program (H.Y. Wang)의 지원을 받습니다. 우리는 Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris(BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (신경 외과), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Jessie L-S Au 박사 (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), 그리고 Nikon의 지원 팀 (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon 및 Jon Ekman). 우리는 Tang, Yamaguchi, Sharma 's, Au, Siemann 및 Guan의 연구소의 모든 구성원과 UF MAE 부서의 모든 직원의 효과적인 지원에 깊이 감사드립니다.

1. CRISPR / Cas9 엔지니어링 B2B 셀의 유지 보수
<ol><li>B2B 세포를 RPMI-1640이 보충된 T25 플라스크에서 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 배양합니다.</li>
	<li>B2B 세포를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 유지한다.</li>
	<li>B2B 세포를 계대배양하면 컨플루언시가 70% 내지 80%에 도달한다.</li>
	<li>B2B 세포주를 -80°C 냉동고에서 10%(v/v) DMSO가 있는 RPMI-1640 배양 배지에 보?...

자성 마이크로비드의 내재화(섹션 2.2)는 세포외 마이크로비드가 핵에 직접 힘을 가할 수 없기 때문에 중요합니다. 힘 적용 및 이미징 (섹션 5.3)은이 실험에서 중요한 단계이며 핵을 변형시키고 의미있는 생물학적 결과를 유도하는 데 필요한 힘은 샘플에 따라 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 힘 크기 (0.8 nN 및 1.4 nN)는 덜 민감한 세포에서 핵 기계 감지를 유발하기 위해 더 증가 될 수 있습니다.
...

이 연구는 세포핵에 직접 기계적 힘을 가하는 자기 액추에이터와 구조적 및 기능적 세포 내 변화를 동시에 이미지화하는 공초점 형광 현미경을 결합하여 핵 기계 생물학을 해명하는 새로운 기술을 개발하고 적용하는 것을 목표로 합니다. 세포는 조직 경직 1,2,3,4, 간질 유체 압력 및 전단 응력 5,6,7, 표면 토폴로지 / 기하학 8,9,10,11,12 및 인장 / 압축 응력13,14를 포함한 세포 외 생물 물리학 적 신호를 감지합니다. 15,16. 생물 물리학 적 신호는 생화학 적 신호로 변환되어 유전자 발현 및 세포 행동의 잠재적 인 다운 스트림 변화를 유발합니다 - 기계 전달 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27로 알려진 과정 . 기계변환 과정을 연구하기 위해, 원자력 현미경(28), 세포 연신 장치(29), 바이오-MEMS(마이크로-전자 기계 시스템) 힘 센서(15,30,31), 전단 유변학(32) 및 스테레오 비전 시스템(33)과 같은 세포에 기계적 힘을 가하기 위한 무수한 기술이 개발되었다. . 최근의 리뷰는 세포 외 기계적 신호를 적용하고 기계 감지34를 방해하는 접근법을 요약합니다. 현재까지 이러한 방법의 대부분은 세포 원형질막에 힘을 가하고 세포는 인테그린, 카데린, 이온 채널 및 G-단백질 결합 수용체와 같은 막 수용체를 통해 이러한 세포외 생물물리학적 신호를 직접 수신합니다. 그 후, 그들은 세포 내 세포 골격과 핵에 신호를 전달합니다. 예를 들어, 예 연관 단백질 (YAP) 전좌를 기계 감지의 지표로 사용하여 세포는 세포막에서 기질 경화 및 세포 외 장력의 기계적 신호를 감지하고 세포 골격을 통해 핵으로 전달하여 YAP 세포질-핵 전좌를 유도하는 것으로 나타났습니다28,35.
최근의 증거는 세포핵 자체가 독립적 인 기계 센서 8,36,37임을 시사한다. 이것은 세포로부터 수확 된 분리 된 핵에 대해 수행 된 실험에 의해 입증되며, 핵은 그들에게 직접 가해지는 기계적 힘에 반응하여 강성을 적응 적으로 변화시키는 것으로 밝혀졌다36. 많은 생리적 조건 동안, 종양 및 건강한 세포 모두의 핵은 세포 외 생물 물리학 적 신호를 감지하고 기계적 성질 및 어셈블리를 변화시킨다38,39,40. 예를 들어, 혈관 외 유출시, 종양 세포의 핵 경직은 감소하고 24 시간38 이상 동안 부드러움을 유지합니다. 제한된 간질 공간을 통해 이동하는 동안, 종양 세포의 핵은 종종 구조적 완전성을 잃고 회복한다39. 그러나 핵이 생물 물리학 적 신호를 감지하는 방식은 알려져 있지 않지만 Lamin A / C 및 핵 골격 및 세포 골격 (LINC) 복합체38,41의 링커와 같은 여러 핵 외피 단백질 및 단백질 계열이 관여하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 핵에 직접 힘을 가할 수있는 새로운 비 침습적 방법은 세포-원형질막과 세포 골격에서 힘 전달 효과를 분리하고 이전에는 접근 할 수 없었던 핵 기계 감지의 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
세포 소기관(42)과 세포(43)에 주입된 마이크로비드를 조작하기 위해 광학 핀셋을 사용한 연구는 핵에 직접 힘을 가하는 기술적 능력을 보여주었다. 그러나, 광학 핀셋 기술은 몇 가지 한계를 갖는다: (1) 낮은 처리량 - 광학 핀셋은 종종 한 번에 하나의 셀 또는 마이크로비드만을 조작하고; (2) 핵의 잠재적 광손상 및 온도 인공물-변형은 수십pN36을 필요로 하고, 상응하는 필요한 레이저 출력은 pN(44,45)당 약 10mW이다. 이러한 레이저 강도는 실험(46) 동안 세포에서의 광손상 및 교란 세포 기능을 유발하기에 충분하다.
살아있는 세포 내의 마이크로 비드를 통해 가해지는 자기력은 핵에 직접 힘을 가할 수있는 잠재력을 보여주고 광학 핀셋의 한계를 극복합니다. 마이크로비드가 세포질로 전달되면 자기장은 고처리량 방식으로 여러 마이크로비드에 동시에 자기력을 가할 수 있습니다. 자기장은 셀 기능(47)에 영향을 미치지 않지만, pN에서 nN으로의 힘을 발생시키며, 이는 핵 변형(36,48,49)을 유도하기에 충분하다. 현재까지, 자성 마이크로비드의 조작은 세포 원형질막(4)8, 세포질(50) 내부, F-액틴(51), 핵(47) 내부, 및 단리된 핵(36)에 적용되었다. 그러나 마이크로 비드의 자기 조작은 핵의 기계 변환을 연구하기 위해 핵 외피에 직접적인 기계적 힘을 가하는 데 사용 된 적이 없습니다.
이 논문에서는 자성 마이크로비드를 세포질에 비침습적으로 전달하고 이러한 마이크로비드를 사용하여 핵에 기계적 힘을 가하는 간단한 기술을 개발했습니다(그림 1). 여기에서 mNeonGreen21-10/11 태그 YAP를 내인성으로 발현하는 CRISPR/Cas9 조작된 인간 정상 B2B 세포주를 사용하여 방법을 검증합니다. YAP는 기계-민감성 단백질이고, YAP의 전좌는 핵-기계-센싱14,28에 의해 조절된다. CRISPR/Cas9 조절 녹인 접근법은 내인성 YAP에 형광 단백질(FP) mNeonGreen21-10/11을 태그하기 위해 선택되었습니다. CRISPR 편집이 불완전한 효율성과 오프 타겟 효과를 갖는 것으로 알려져 있지만, 이전 간행물의 프로토콜은 형광 분류를 통합하여 올바른 개방 판독 프레임 삽입을 선택했습니다52,53,54. 이러한 추가 선택 계층으로, 이전에 생성된 52,53,54,55 20+ 세포주에서 오프-타겟 태깅 이벤트가 관찰되지 않았다. 이것은 분할 형광 단백질 작제물이지만, 원칙적으로 임의의 표현 가능한 형광 태그를 사용할 수 있다. 이 표지 접근법은 전이 유전자 또는 항체 방법보다 우수합니다. 첫째, 전이유전자 발현과 달리, 태그된 단백질은 단일 카피 유전자 투여량을 유지하고 천연 유전자 조절 네트워크의 생리학적 맥락에서 발현하여 단백질 농도, 국소화 및 상호작용의 편차를 제한한다. 이 연구에 사용된 태깅 방법은 전체 FP 태깅보다 훨씬 더 높은 처리량과 효율성을 달성합니다. 또한 고정 인공물 및 고품질, 고특이성 항체의 제한된 가용성으로 인한 면역형광과 관련된 문제를 방지합니다. 둘째, 이 논문에서 사용된 접근 방식은 세포 생리학에 대한 섭동을 최소화하고 모든 내인성 YAP를 실시간으로 실시간으로 밝힐 수 있습니다. 대조적으로, 다른 일반적인 전이 유전자 방법은 종종 YAP의 과발현을 유도합니다. 생성된 인공 분포는 잠재적으로 세포독성을 유발할 수 있고 세포(56,57,58)의 기계-감지에 영향을 미칠 수 있다.
이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 핵에 직접 힘을 가하고 동시 라이브 셀 형광 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 요약하면, 여기에 제시된 프로토콜은 (1) 핵 외부에 있는 동안 자기 마이크로비드를 세포 내로 전달하고, (2) 마이크로비드를 조작하여 핵에 자기력을 가하고, (3) 조작 중에 세포의 컨포칼 형광 이미징을 수행하고, (4) 힘 적용 프로세스 전반에 걸쳐 YAP 핵/세포질(N/C) 비율을 정량적으로 분석하는 방법을 보여줍니다. 결과는 (1) 엔도 사이토 시스를 통해 자성 마이크로 비드가 2 시간 이내에 B7B 세포의 세포질로 비 침습적으로 전달 될 수 있음을 시사합니다 (그림 2 및 그림 3). (2) 핵에 직접 가해지는 정량화된 자기력(그림 4, 그림 5 및 그림 6)만으로도 CRISPR/Cas9 엔지니어링 B2B 세포에서 YAP N/C 비율의 다양한 변화를 유발할 수 있습니다(그림 7 및 그림 8).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

기계 생물학의 근본적인 질문은 살아있는 세포가 세포 생리학 및 병리학의 맥락에서 세포 외 기계적 자극을 감지하는 방법입니다. 세포 외 기계적 자극의 세포 기계 감각은 막 수용체, 관련 단백질 복합체 및 세포 골격을 통해 이루어지는 것으로 여겨집니다. 기계 생물학의 최근 발전은 세포질 자체의 세포핵이 독립적으로 기계적 자극을 동시에 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 그러나 세포핵이 기계적 자극을 감지, 형질도입 및 반응하는 방법에 대한 기계론적 이해는 주로 기존 도구로 핵 역학에 접근하고 정량화하는 기술적 어려움 때문에 부족합니다. 이 백서에서는 정밀하고 비침습적인 3D 기계적 자극을 적용하여 세포핵을 직접 변형시키는 새로운 자기력 액추에이터의 설계, 제조 및 구현에 대해 설명합니다. CRISPR/Cas9 엔지니어링 셀을 사용하여 이 연구는 고해상도 컨포칼 형광 이미징과 결합된 이 도구가 핵 변형의 함수로서 단일 세포에서 기계 민감성 예 관련 단백질(YAP)의 실시간 역학을 밝힐 수 있음을 보여줍니다. 이 간단한 방법은 기계 생물학 커뮤니티의 현재 기술 격차를 해소하고 핵 기계 변환과 세포 기능 사이의 관계에 존재하는 지식 격차에 대한 해답을 제공 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

자석 이동 장치의 설계 및 자기력의 적용 자성 마이크로 비드를 통해 핵에 힘을 가하기 위해 자석의 공간적 위치를 제어하기 위해 자석 이동 장치가 설계 및 제작되었습니다. 자석 이동 장치에는 중앙 프레임, 3개의 손잡이 및 레일이 포함되어 있어 사이클당 1.59mm의 공간 분해능으로 부착된 자석을 x, y 및 z 방향으로 독립적으로 이동할 수 있습니다(그림 1A). 자...

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Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

이 연구는 세포질로 전달되는 자기 마이크로 비드를 통해 세포핵에 기계적 힘을 직접 적용하고 동시 살아있는 세포 형광 이미징을 수행하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

3D 자기력 액추에이터와 다기능 형광 이미징을 결합하여 핵 역학 연구

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

이 방법에서는 힘이 핵에 직접 적용됩니다. 이것은 세포 원형질막과 세포 골격에서 힘 전달 효과를 분리하여 핵 기계 감지의 분자 메커니즘을 드러냅니다. 힘은 비침습적인 방식으로 살아있는 세포 내에 적용됩니다.광학 핀셋에 비해 자기장과 자기력은 셀 기능에 영향을 미치지 않으며 처리량이 더 높습니다. 평균 직경이 7 마이크로미터인 카보닐 철 마이크로비드 0.2 그램의 칭량에 의해 자성 마이크로비드로 세포를 배양하기 시작한다. 마이크로비드를 피펫을 사용하여 1 밀리리터 RPMI 1640 배지에 현탁시킨다.그런 다음 B2B 세포가 있는 페트리 접시를 생물안전 캐비닛으로 가져가 마이크로비드가 포함된 배지 200마이크로리터를 페트리 접시에 빠르게 추가합니다. 마이크로 비드가 세포에 의해 내재화 될 때까지 인큐베이터에 페트리 접시를 넣으십시오. 도립 현미경을 열고 컨포칼 형광 이미징을 사용하여 마이크로비드, 핵 및 세포 경계를 시각화하여 6시간마다 세포주의 내재화를 위한 최적의 시간을 결정합니다.내재화된 마이크로비드는 세포 경계 내에 존재할 것이다. 작은 힘 응용 프로그램 및 라이브 셀 이미징의 경우 소프트웨어 응용 프로그램 Elements를 엽니다. 구성 자기 찾기를 정의하려면 1개 이상의 2개 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 2초당 1프레임으로 설정합니다.핀홀 크기를 1.2 Airy 단위로 설정합니다. FITC 채널만 확인하고 PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정합니다. 구성 자기 YAP 핵을 정의하려면 4개 이상의 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 4초당 1프레임으로 설정합니다.그런 다음 1.2 Airy 유닛 버튼을 클릭하여 핀홀 크기를 1.2 Airy 유닛으로 설정하고 FITC 채널을 확인합니다. PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정합니다. 핵 경계 및 핵 염색 강도를 이미징하려면 시아닌 5 채널을 확인하십시오.1.2 Airy 단위 버튼을 클릭하지 말고 PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정하십시오. 핀홀 크기는 3차원 YES 관련 단백질 이미징에 최적화됩니다. 그런 다음 엘리먼츠를 통해 DIA를 켭니다.스핀 뷰를 열고 명시야를 사용하고 물체의 초점을 조정하여 초점이 맞는 세포의 선명한 이미지를 얻습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 내부에 단일 마이크로비드가 있는 세포, 내부에 여러 마이크로비드가 있는 셀, 내부에 마이크로비드가 없는 셀과 같은 세 가지 조건에서 적절한 다중 단일 셀을 찾습니다. 그런 다음 40X 대물렌즈로 전환하고 적절한 위치 번호로 이 위치의 이름을 지정합니다.요소를 열고 자기 찾기를 클릭하고 인터록을 제거한 다음 탭을 스캔한 다음 상단 및 하단 버튼을 선택하여 선택한 셀의 Z 스택에 대한 하한과 상한을 설정하기 위해 초점면의 Z 위치를 조정합니다. 스캔을 다시 클릭하여 스캔을 중지합니다. 자기 YAP 핵 구성으로 전환하고 파일 이름을 before_small_force.nd2로 설정합니다.기록된 Z 스택이 있는 실행 버튼을 클릭합니다. 올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 스핀보기를 열고 녹음 버튼을 클릭하십시오.자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 페트리 접시 바닥에서 46mm 위로 자석을 이동합니다. 비디오를 저장하고 확인하여 자기력에 의해 유도된 마이크로비드 변위를 확인합니다. 파일 이름을 after_small_force.nd2로 설정하여 스캔 절차를 반복합니다.그런 다음 오른쪽 조명 경로로 전환하고 DIA를 켜고 녹음 버튼을 클릭하기 전에 스핀보기를 엽니 다. 자석 이동 장치 손잡이를 페트리 접시 바닥에서 최대 120mm까지 돌리고 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다. 파일 이름을 before_large_force.nd2로 설정하여 스캔 단계를 반복합니다.마이크로비드는 FITC 또는 시아닌 5 채널에서 레이저 여기 하에서 형광을 방출할 수 없습니다. 따라서, 내재화된 마이크로비드는 YES 관련 단백질 및 핵의 형광의 공초점 이미징에 위치한 어두운 중공에 의해 확인되었다. 핵 원형도는 대조군 세포와 마이크로비드 내재화를 갖는 세포 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았다.마이크로비드와 공동 배양되었지만 내재화가 없는 대조군 세포와 마이크로비드 내재화가 있는 세포의 YES 관련 단백질 세포핵 대 세포질 비율도 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 액틴의 핵 변형 및 해중합은 세포 골격 함유 세포에서 마이크로 비드에 의해 적용된 압축력에 의해 발생했습니다. 정량적 AFM 힘 변위 관계에 의해 제공되는 정량적 이미징 분석 교정 곡선.이러한 관계에 기초하여, 적용된 비드 힘이 추정되었다. 핵 변형 및 YES-관련 단백질 전좌는 적용 또는 자기력의 방출 시 관찰되었다. 녹색 채널에서 YES 관련 단백질의 강도 변화 및 적색 채널에서 핵 염색의 변화가 없는 것은 YES 관련 단백질 전좌에 의해 유발된 자기력 유도 핵 변형임을 확인하였다.두 그룹 내에서 YES 관련 단백질 핵 대 세포질 비율의 순 변화의 정량화는 세포질 내 마이크로 비드에 적용된 자기력이 YES- 관련 단백질 전좌를 유도하고 YES- 관련 단백질 핵 대 세포질 비율을 변화 시켰음을 확인했다. 힘과 이미징을 적용하기 전에 세포가 자성 마이크로비드를 내재화하고 비드가 세포 경계 내에 있는지 확인하십시오.

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