Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
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Este projeto é financiado pelo UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), o UFHCC Pilot Award (X. T. e Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) e UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Agradecemos sinceramente as discussões intelectuais e o apoio técnico do Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurocirurgia), Dr. Tian He (Universidade de Harvard), Dr. Youhua Tan (Universidade Politécnica de Hong Kong), Dr. Jessie L-S Au (Instituto de Farmacologia de Sistemas Quantitativos), Dr. David Hahn (Universidade do Arizona), e Equipe de Suporte da Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Estamos profundamente gratos pelo apoio efetivo de todos os membros dos laboratórios de pesquisa de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann e Guan e todos os membros da equipe do Departamento de MAE da UF.

1. Manutenção de células B2B projetadas por CRISPR/Cas9
<ol><li>Cultura de células B2B em frasco T25 com RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Manter as células B2B em incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Subcultura das células B2B quando a confluência atingir 70% a 80%.</li>
	<li>Armazenar a linhagem celular B2B em meio de cultura RPMI-1640 com 10% (v/v) de DMSO em um freezer de -80 °C.</li>
	<li>Use as c...

A internalização das microesferas magnéticas (secção 2.2) é crítica porque as microesferas extracelulares não podem aplicar força diretamente ao núcleo. A aplicação de força e a imagem (secção 5.3) são etapas críticas nesta experiência, e a força necessária para deformar o núcleo e induzir consequências biológicas significativas pode ser dependente da amostra. A magnitude da força neste experimento (0,8 nN e 1,4 nN) pode ser aumentada ainda mais para desencadear a detecção de mecano nuclear em c...

Este estudo tem como objetivo desenvolver e aplicar uma nova técnica para elucidar a mecanobiologia do núcleo, combinando os atuadores magnéticos que aplicam força mecânica diretamente no núcleo celular e a microscopia de fluorescência confocal que simultaneamente visualiza as alterações estruturais e funcionais subcelulares. As células detectam sinais biofísicos extracelulares, incluindo rigidez tecidual 1,2,3,4, pressão do fluido intersticial e tensão de cisalhamento 5,6,7, topologia/geometria da superfície 8,9,10,11,12 e tensão de tensão/compressão13,14, 15,16. Os sinais biofísicos são convertidos em sinais bioquímicos e desencadeiam potenciais alterações a jusante da expressão gênica e dos comportamentos celulares - um processo conhecido como mecanotransdução 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Para estudar os processos de mecanotransdução, uma infinidade de técnicas foram desenvolvidas para aplicar força mecânica nas células, como microscopia de força atômica28, dispositivo de alongamento celular29, sensor de força bio-MEMS (sistemas microeletromecânicos) 15,30,31, reologia de cisalhamento 32 e Sistema de Visão Estéreo 33 . Uma revisão recente resume as abordagens para aplicar pistas mecânicas extracelulares e interferir no mecananosense34. Até o momento, a maioria desses métodos aplica força na membrana plasmática celular, e as células recebem diretamente esses sinais biofísicos extracelulares por meio de receptores de membrana, como integrina, caderina, canais iônicos e receptores acoplados à proteína G. Posteriormente, eles transmitem o sinal para o citoesqueleto e núcleo intracelular. Por exemplo, usando a translocação de proteína associada ao sim (YAP) como um indicador de mecanosensoriamento, as células mostram sentir os sinais mecânicos de rigidez do substrato e tensão extracelular da membrana celular e transmiti-los através do citoesqueleto para o núcleo para induzir a translocação citoplasma para núcleo YAP28,35.
Evidências recentes sugerem que o próprio núcleo celular é um mecano-sensor independente 8,36,37. Isso é comprovado por experimentos realizados no núcleo isolado colhido de células, onde foi revelado que os núcleos mudam adaptativamente sua rigidez em resposta à força mecânica diretamente aplicada sobre eles36. Durante muitas condições fisiológicas, os núcleos em células tumorais e saudáveis detectam sinais biofísicos extracelulares e alteram suas propriedades mecânicas e montagens38,39,40. Por exemplo, após o extravasamento, a rigidez nuclear das células tumorais diminui e mantém a maciez por mais de 24 h38. Durante a migração através do espaço intersticial confinado, os núcleos das células tumorais frequentemente perdem e recuperam sua integridade estrutural39. No entanto, a forma como o núcleo detecta o sinal biofísico é desconhecida, embora várias proteínas do envelope nuclear e famílias de proteínas tenham sido encontradas envolvidas, como a lamina A / C e o ligador do complexo nucleoesqueleto e citoesqueleto (LINC)38,41. Assim, novos métodos não invasivos que podem aplicar força diretamente ao núcleo dissociarão o efeito da transmissão de força da membrana plasmática celular e do citoesqueleto e ajudarão a elucidar os mecanismos moleculares anteriormente inacessíveis do mecanismo nuclear.
Pesquisas que empregaram pinças ópticas para manipular organelas42 e microesferas injetadas nas células43 mostraram a capacidade tecnológica de aplicar diretamente força no núcleo. No entanto, a técnica óptica-pinça tem várias limitações: (1) pinças ópticas de baixo rendimento geralmente manipulam apenas uma célula ou microesferas de cada vez; e (2) o potencial fotodano e a temperatura artefato-deformação do nuclear requerem dezenas de pN36, e a potência necessária correspondente do laser é de cerca de 10 mW por pN44,45. Essa intensidade de laser é suficiente para desencadear fotodanos nas células e perturbar as funções celulares durante o experimento46.
A força magnética aplicada através de microesferas dentro de células vivas mostra o potencial de aplicar força diretamente no núcleo e supera as limitações das pinças ópticas. Uma vez que as microesferas são entregues no citoplasma, um campo magnético pode exercer uma força magnética em várias microesferas simultaneamente de uma maneira de alto rendimento. O campo magnético não influencia as funções celulares47, mas gera força de pN a nN, o que é suficiente para induzir a deformação nuclear 36,48,49. Até o momento, a manipulação de microesferas magnéticas tem sido aplicada na membrana plasmática celular48, no interior do citoplasma50, na actina F51, no interior do núcleo47 e no núcleo isolado36. No entanto, a manipulação magnética de microesferas nunca foi usada para aplicar força mecânica direta no envelope nuclear para estudar a mecanotransdução no núcleo.
Neste trabalho, uma técnica simples é desenvolvida para entregar microesferas magnéticas no citoplasma de forma não invasiva e usar essas microesferas para aplicar força mecânica no núcleo (Figura 1). Aqui, linhagens celulares B2B humanas normais projetadas por CRISPR/Cas9 que expressam endogenamente o YAP marcado com mNeonGreen21-10/11 são usadas para validar o método. A YAP é uma proteína mecano-sensível, e a translocação da YAP é regulada pela detecção mecânica nuclear14,28. A abordagem knock-in regulada por CRISPR/Cas9 foi escolhida para marcar YAP endógeno com uma proteína fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Embora a edição CRISPR seja conhecida por ter eficiência incompleta e efeito fora do alvo, os protocolos em publicações anteriores integraram a classificação por fluorescência para selecionar a inserção correta do quadro de leitura aberta52,53,54. Com essa camada adicional de seleção, nenhum evento de marcação fora do alvo foi observado em mais de 20 linhagens celulares geradas anteriormente52,53,54,55. Esta é uma construção de proteína fluorescente dividida, mas, em princípio, qualquer tag fluorescente expressável poderia ser utilizável. Esta abordagem de marcação é superior aos métodos transgênicos ou de anticorpos. Primeiro, ao contrário da expressão transgênica, a proteína marcada mantém a dosagem do gene de cópia única e se expressa no contexto fisiológico da rede reguladora de genes nativos, limitando desvios na concentração, localização e interação da proteína. O método de marcação usado neste estudo alcança uma taxa de transferência e eficiência mais altas do que a marcação completa de FP. Também evita desafios associados à imunofluorescência devido a artefatos de fixação e à disponibilidade limitada de anticorpos de alta qualidade e alta especificidade. Em segundo lugar, a abordagem usada neste artigo faz uma perturbação mínima para a fisiologia celular e permite a revelação em tempo real de todos os YAPs endógenos autenticamente. Em contraste, outros métodos transgênicos comuns muitas vezes levam à superexpressão de YAP. A distribuição artificial resultante pode potencialmente causar citotoxicidade e afetar a detecção mecanogênica das células56,57,58.
Este estudo apresenta um protocolo para aplicar diretamente força sobre o núcleo através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas. Em resumo, os protocolos aqui apresentados demonstram como (1) entregar microesferas magnéticas na célula enquanto estão fora do núcleo, (2) manipular as microesferas para aplicar força magnética no núcleo, (3) realizar imagens fluorescentes confocais das células durante a manipulação e (4) analisar quantitativamente a relação YAP nuclear/citoplasma (N/C) durante todo o processo de aplicação da força. Os resultados sugerem que (1) através da endocitose, as microesferas magnéticas podem ser entregues de forma não invasiva no citoplasma das células B2B dentro de 7 h (Figura 2 e Figura 3); e (2) a força magnética quantificada aplicada diretamente no núcleo (Figura 4, Figura 5 e Figura 6) isoladamente pode desencadear diversas alterações da relação N/C YAP em células B2B projetadas por CRISPR/Cas9 (Figura 7 e Figura 8).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

Uma questão fundamental na mecanobiologia é como as células vivas sentem estímulos mecânicos extracelulares no contexto da fisiologia e patologia celular. Acredita-se que a sensação mecano-celular de estímulos mecânicos extracelulares seja através dos receptores de membrana, do complexo proteico associado e do citoesqueleto. Avanços recentes na mecanobiologia demonstram que o núcleo celular no próprio citoplasma pode sentir independentemente estímulos mecânicos simultaneamente. No entanto, falta uma compreensão mecanicista de como o núcleo celular detecta, transduz e responde a estímulos mecânicos, principalmente por causa dos desafios técnicos no acesso e quantificação da mecânica do núcleo por ferramentas convencionais. Este artigo descreve o projeto, fabricação e implementação de um novo atuador de força magnética que aplica estímulos mecânicos 3D precisos e não invasivos para deformar diretamente o núcleo celular. Usando células modificadas por CRISPR/Cas9, este estudo demonstra que esta ferramenta, combinada com imagens fluorescentes confocais de alta resolução, permite a revelação da dinâmica em tempo real de uma proteína associada ao sim (YAP) mecanósquia em células individuais em função da deformação do núcleo. Este método simples tem o potencial de preencher a lacuna tecnológica atual na comunidade de mecanobiologia e fornecer respostas para a lacuna de conhecimento que existe na relação entre a mecanotransdução do núcleo e a função celular.

Projeto de um dispositivo de movimento magnético e aplicação de força magnética Para aplicar força no núcleo através das microesferas magnéticas, um dispositivo de movimento magnético foi projetado e construído para controlar a posição espacial do ímã. O dispositivo de movimento magnético contém uma estrutura central, três botões e trilhos para mover o ímã conectado nas direções x, y e z independentemente na resolução espacial de 1,59 mm por ciclo (Figura ...

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Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Este estudo apresenta um novo protocolo para aplicar diretamente força mecânica no núcleo celular através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas.

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

Neste método, a força é aplicada diretamente ao núcleo. Isso desacopla o efeito de transmissão de força da membrana plasmática celular e do citoesqueleto, revelando os mecanismos moleculares do mecanosense nuclear. A força é aplicada dentro das células vivas de forma não invasiva.Em comparação com as pinças ópticas, o campo magnético e a força magnética não afetam as funções celulares e têm maior rendimento. Comece a cultivar as células com microesferas magnéticas pesando 0,2 gramas de microesferas de ferro carbonila com sete micrômetros de diâmetro médio. Suspenda as microesferas em um meio de cultura RPMI 1640 mililitro usando uma pipeta.Em seguida, leve a placa de Petri com células B2B para o armário de biossegurança e adicione rapidamente 200 microlitros do meio contendo microesferas na placa de Petri. Coloque a placa de Petri em uma incubadora até que as microesferas sejam internalizadas pelas células. Abra o microscópio invertido e, usando imagens de fluorescência confocal, determine o tempo ideal para a internalização das linhagens celulares a cada seis horas, visualizando o limite de microesferas, nucleares e celulares.As microesferas internalizadas estarão presentes dentro do limite celular. Para aplicativos de pequena força e imagens de células vivas, abra o aplicativo de software Elements. Para definir a configuração de localização magnética, clique no botão um sobre dois para definir a velocidade de digitalização para um quadro a cada dois segundos.Defina o tamanho do orifício para 1,2 unidade Airy. Verifique apenas o canal FITC e defina PMT HV como 70, deslocado como zero, intensidade do laser como 10. Para definir o núcleo YAP magnético de configuração, defina a velocidade de digitalização para um quadro a cada quatro segundos clicando no botão um sobre quatro.Em seguida, clique no botão da unidade 1.2 Airy para definir o tamanho do orifício para a unidade 1.2 Airy e verifique o canal FITC. Defina PMT HV como 70, deslocado como zero, intensidade do laser como 10. Para obter imagens do limite do núcleo e da intensidade da mancha nuclear, verifique o canal 5 da cianina 5.Não clique no botão da unidade 1.2 Airy e defina PMT HV para 70, deslocamento para zero e intensidade do laser para 10. O tamanho do orifício será otimizado para imagens tridimensionais de proteínas associadas ao YES. Em seguida, ative o DIA por meio de Elementos.Abra a visualização de rotação, use um campo brilhante e ajuste o foco do objeto para obter uma imagem clara em foco das células. Use um objetivo de 10X para encontrar várias células únicas apropriadas em três condições, como uma célula com uma única microesferas dentro, com várias microesferas dentro e sem nenhuma microesferas dentro. Em seguida, mude para a objetiva 40X e nomeie essa posição com o número de posição apropriado.Abra Elementos, clique em localizar magnético, remova o intertravamento, digitalize as guias e selecione os botões superior e inferior para ajustar a posição Z do plano focal para definir o limite inferior e superior para a pilha Z das células selecionadas. Pare a digitalização clicando em Analisar novamente. Alterne para a configuração do núcleo magnético YAP e defina o nome do arquivo como before_small_force.nd2.Clique no botão Executar com a pilha Z gravada. Alterne para o caminho da luz à direita e ligue o DIA. Abra a visualização de rotação e clique no botão de gravação.Mova o ímã para 46 milímetros acima do fundo da placa de Petri girando o botão do dispositivo de movimento do ímã. Salve e verifique o vídeo para confirmar o deslocamento de microesferas induzido pela força magnética. Repita o procedimento de varredura definindo o nome do arquivo como after_small_force.nd2.Em seguida, alterne para o caminho de luz à direita, ative o DIA e abra a visualização de rotação antes de clicar no botão de gravação. Gire o botão do dispositivo móvel do ímã até 120 milímetros acima da parte inferior da placa de Petri e salve uma sequência de imagens ou vídeos de campo brilhante. Repita as etapas de varredura definindo o nome do arquivo como before_large_force.nd2.As microesferas não podem emitir fluorescência sob excitação a laser no canal FITC ou cianina 5. Assim, as microesferas internalizadas foram identificadas pelo oco escuro localizado na imagem confocal de fluorescência da proteína e núcleo associados ao YES. A circularidade nuclear não mostrou diferença significativa entre as células de controle e as células com internalização de microesferas.A relação núcleo-citoplasma de células proteicas associadas ao YES de células de controle co-cultivadas com microesferas, mas sem internalização, e células com internalização de microesferas também não mostrou diferença significativa. A deformação do núcleo e a despolimerização da actina foram causadas pela força de compressão aplicada pelas microesferas em células contendo citoesqueleto. A curva de calibração da análise quantitativa de imagens fornecida pela relação quantitativa de deslocamento da força AFM.Com base nessa relação, estimou-se a força aplicada das contas. A deformação do núcleo e a translocação proteica associada ao YES foram observadas na aplicação ou liberação da força magnética. As mudanças de intensidade na proteína associada ao SIM no canal verde e nenhuma alteração na coloração do núcleo no canal vermelho confirmaram que a deformação nuclear induzida pela força magnética desencadeada pela translocação de proteína associada ao YES.A quantificação da mudança líquida da relação núcleo/citoplasma da proteína associada ao YES dentro de dois grupos confirmou que a força magnética aplicada às microesferas dentro do citoplasma induziu a translocação de proteínas associadas ao YES e alterou a relação núcleo-citoplasma da proteína associada ao YES. Antes de aplicar força e imagem, certifique-se de que as células internalizaram as microesferas magnéticas e as contas estão dentro do limite celular.

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