Name: combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology at JoVE.com

Bu proje UF Gatorade Ödülü Başlangıç Paketi (X. T.), UFHCC Pilot Ödülü (X. T. ve Dr. Dietmar Siemann), UF Fırsat Tohum Fonu (X. T.) ve UFHCC Üniversitesi Bilim İnsanları Programı (H. Y. Wang) tarafından finanse edilmektedir. Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Nöroşirürji), Dr. Tian He (Harvard Üniversitesi), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Politeknik Üniversitesi), Dr. Jessie L-S Au (Kantitatif Sistemler Farmakoloji Enstitüsü), Dr. David Hahn (Arizona Üniversitesi), ve Nikon Destek Ekibi (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon ve Jon Ekman). Tang'ın, Yamaguchi'nin, Sharma'nın, Au'nun, Siemann'ın ve Guan'ın araştırma laboratuvarlarının tüm üyelerinden ve UF MAE Departmanının tüm personelinden gelen etkili destek için derinden minnettarız.

1. CRISPR / Cas9 mühendisliği B2B hücrelerinin bakımı
<ol><li>RPMI-1640'lı bir T25 şişesindeki kültür B2B hücreleri,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenir.</li>
	<li>B2B hücrelerini nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.</li>
	<li>Alt kültür, B2B hücreleri, akıcılık% 70 ila% 80'e ulaştığında.</li>
	<li>B2B hücre hattını RPMI-1640 kültür ortamında, %10 (v/v) DMSO ile -80 °C dondurucuda saklayın.</li>
	<li>D...

Manyetik mikroboncukların içselleştirilmesi (bölüm 2.2) kritiktir, çünkü hücre dışı mikroboncuklar doğrudan çekirdeğe kuvvet uygulayamaz. Kuvvet uygulaması ve görüntüleme (bölüm 5.3) bu deneydeki kritik adımlardır ve çekirdeği deforme etmek ve anlamlı biyolojik sonuçlara neden olmak için gereken kuvvet örneğe bağlı olabilir. Bu deneydeki kuvvet büyüklüğü (0.8 nN ve 1.4 nN), daha az hassas hücrelerde nükleer mekano-algılamayı tetiklemek için daha da arttırılabilir.
<p class=...

Bu çalışma, mekanik kuvveti doğrudan hücre çekirdeğine uygulayan manyetik aktüatörler ile yapısal ve fonksiyonel hücre altı değişiklikleri aynı anda görüntüleyen konfokal floresan mikroskobu birleştirilerek çekirdek mekanobiyolojisini aydınlatmak için yeni bir teknik geliştirmeyi ve uygulamayı amaçlamaktadır. Hücreler, doku sertliği 1,2,3,4, interstisyel sıvı basıncı ve kesme gerilmesi 5,6,7, yüzey topolojisi / geometrisi 8,9,10,11,12 ve gerilim / sıkıştırma gerilimi 13,14 dahil olmak üzere hücre dışı biyofiziksel sinyalleri algılar. 15,16. Biyofiziksel sinyaller biyokimyasal sinyallere dönüştürülür ve gen ekspresyonunun ve hücre davranışlarının potansiyel aşağı akış değişikliklerini tetikler - mekanotransdüksiyon 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 olarak bilinen bir süreç . Mekanotransdüksiyon süreçlerini incelemek için, atomik kuvvet mikroskobu 28, hücre germe cihazı29, biyo-MEMS (mikro-elektromekanik sistemler) kuvvet sensörü 15,30,31, kesme reolojisi32 ve StereoGörüş Sistemi 33 gibi hücrelere mekanik kuvvet uygulamak için sayısız teknik geliştirilmiştir. . Yakın tarihli bir derleme, hücre dışı mekanik ipuçlarını uygulamak ve mekanosensing'e müdahale etmek için yaklaşımları özetlemektedir34. Bugüne kadar, bu yöntemlerin çoğu hücre plazma zarına kuvvet uygular ve hücreler bu hücre dışı biyofiziksel sinyalleri doğrudan integrin, kadherin, iyon kanalları ve G-Proteini bağlı reseptörler gibi membran reseptörleri aracılığıyla alırlar. Daha sonra, sinyali hücre içi hücre iskeletine ve çekirdeğe iletir. Örneğin, mekano-algılamanın bir göstergesi olarak evet ilişkili protein (YAP) translokasyonu kullanılarak, hücrelerin substrat sertliğinin ve hücre dışı gerilimin mekanik sinyallerini hücre zarından algıladıkları ve YAP sitoplazmasından çekirdeğe translokasyonunu indüklemek için bunları hücre iskeletinden çekirdeğe ilettikleri gösterilmiştir28,35.
Son kanıtlar, hücre çekirdeğinin kendisinin bağımsız bir mekano-sensör 8,36,37 olduğunu göstermektedir. Bu, hücrelerden toplanan izole çekirdek üzerinde yapılan deneylerle kanıtlanmıştır; burada çekirdeklerin, doğrudan üzerlerine uygulanan mekanik kuvvete yanıt olarak sertliklerini adaptif olarak değiştirdiği ortaya çıkmıştır36. Birçok fizyolojik durumda, hem tümör hem de sağlıklı hücrelerdeki çekirdekler hücre dışı biyofiziksel sinyalleri algılar ve mekanik özelliklerini ve düzeneklerini değiştirir38,39,40. Örneğin, ekstravazasyon üzerine, tümör hücrelerinin nükleer sertliği azalır ve 24 saat38'in üzerinde yumuşaklığı korur. Kapalı interstisyel boşluktan göç sırasında, tümör hücrelerinin çekirdekleri sıklıkla yapısal bütünlüklerini kaybeder ve geri kazanır39. Bununla birlikte, çekirdeğin biyofiziksel sinyali algılama şekli bilinmemekle birlikte, Lamin Klima ve nükleoskeleton ve sitoiskelet (LINC) kompleksi 38,41'in bağlayıcısı gibi çeşitli nükleer zarf proteinleri ve protein ailelerinin dahil olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulayabilen yeni invaziv olmayan yöntemler, kuvvet iletiminin etkisini hücre-plazma zarından ve sitoiskeletten ayıracak ve nükleer mekano-algılamanın daha önce erişilemeyen moleküler mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacaktır.
Organel 42'yi manipüle etmek için optik cımbız kullanan ve hücrelere enjekte edilen mikroboncuklar43'ü kullanan araştırmalar, çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulamanın teknolojik yeteneğini gösterdi. Bununla birlikte, optik-cımbız tekniğinin birkaç sınırlaması vardır: (1) düşük verimli optik cımbız genellikle bir seferde yalnızca bir hücreyi veya mikroboncuğu manipüle eder; ve (2) nükleerin potansiyel fotohasarı ve sıcaklık artefakt-deformasyonu onlarca pN36 gerektirir ve karşılık gelen gerekli lazer gücü pN44,45 başına yaklaşık 10 mW'dir. Bu tür lazer yoğunluğu, hücrelerdeki fotohasarı tetiklemek ve deney46 sırasında hücre fonksiyonlarını bozmak için yeterlidir.
Canlı hücrelerdeki mikroboncuklar yoluyla uygulanan manyetik kuvvet, çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulama potansiyelini gösterir ve optik cımbızların sınırlamalarının üstesinden gelir. Mikroboncuklar sitoplazmaya verildikten sonra, manyetik bir alan aynı anda yüksek verimli bir şekilde birden fazla mikroboncuk üzerinde manyetik bir kuvvet uygulayabilir. Manyetik alan hücre fonksiyonlarını etkilemez47, ancak pN'den nN'ye kuvvet üretir, bu da nükleer deformasyonu indüklemek için yeterlidir 36,48,49. Bugüne kadar, manyetik mikroboncukların manipülasyonu hücre plazma zarı48, sitoplazma50 içinde, F-aktin51, çekirdek47 içinde ve izole çekirdek36 üzerinde uygulanmıştır. Bununla birlikte, mikroboncukların manyetik manipülasyonu, çekirdekteki mekanotransdüksiyonu incelemek için nükleer zarf üzerine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak için hiçbir zaman kullanılmamıştır.
Bu yazıda, manyetik mikroboncukları sitoplazmaya invaziv olmayan bir şekilde iletmek ve bu mikroboncukları çekirdeğe mekanik kuvvet uygulamak için kullanmak için basit bir teknik geliştirilmiştir (Şekil 1). Burada, yöntemi doğrulamak için mNeonGreen21-10/11 etiketli YAP'ı endojen olarak eksprese eden CRISPR / Cas9 mühendisliği insan normal B2B hücre hatları kullanılır. YAP, mekanoya duyarlı bir proteindir ve YAP'ın translokasyonu nükleer mekano-algılama14,28 ile düzenlenir. Endojen YAP'ı floresan protein (FP) mNeonGreen21-10/11 ile etiketlemek için CRISPR / Cas9 tarafından düzenlenmiş knock-in yaklaşımı seçildi. CRISPR düzenlemesinin eksik verimliliğe ve hedef dışı etkiye sahip olduğu bilinmesine rağmen, önceki yayınlardaki protokoller, doğru açık okuma çerçevesi ekleme52,53,54'ü seçmek için floresan sıralamayı entegre etti. Bu ek seçim katmanıyla, daha önce 52,53,54,55 oluşturulan 20'den fazla hücre satırında hedef dışı etiketleme olayı gözlenmedi. Bu bölünmüş bir floresan protein yapısıdır, ancak prensip olarak, herhangi bir ifade edilebilir floresan etiketi kullanılabilir olabilir. Bu etiketleme yaklaşımı transgen veya antikor yöntemlerinden daha üstündür. İlk olarak, transgen ekspresyonundan farklı olarak, etiketli protein, tek kopyalı gen dozajını korur ve doğal gen düzenleyici ağın fizyolojik bağlamında, protein konsantrasyonundaki, lokalizasyonundaki ve etkileşimindeki sapmaları sınırlayarak ifade eder. Bu çalışmada kullanılan etiketleme yöntemi, tam FP etiketlemeden daha yüksek bir büyüklük sırasına göre daha yüksek verim ve verimlilik elde etmektedir. Ayrıca, fiksasyon artefaktları ve yüksek kaliteli, yüksek özgüllüklü antikorların sınırlı mevcudiyeti nedeniyle immünofloresan ile ilişkili zorlukları da önler. İkincisi, bu makalede kullanılan yaklaşım, hücre fizyolojisinde minimum bozulma sağlar ve tüm endojen YAP'ların gerçek zamanlı olarak ortaya çıkarılmasını sağlar. Buna karşılık, diğer yaygın transgen yöntemleri sıklıkla YAP'ın aşırı ekspresyonuna yol açar. Ortaya çıkan yapay dağılım potansiyel olarak sitotoksisiteye neden olabilir ve hücrelerin mekano-algılamasını etkileyebilir56,57,58.
Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla çekirdeğe doğrudan kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için bir protokol sunmaktadır. Özetle, burada sunulan protokoller, (1) çekirdeğin dışındayken manyetik mikroboncukların hücreye nasıl iletileceğini, (2) çekirdeğe manyetik kuvvet uygulamak için mikroboncukların nasıl manipüle edileceğini, (3) manipülasyon sırasında hücrelerin konfokal floresan görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve (4) kuvvet uygulama süreci boyunca YAP nükleer / sitoplazma (N / C) oranının nicel olarak nasıl analiz edileceğini göstermektedir. Sonuçlar, (1) endositoz yoluyla, manyetik mikroboncukların 7 saat içinde B2B hücrelerinin sitoplazmasına invaziv olmayan bir şekilde verilebileceğini göstermektedir (Şekil 2 ve Şekil 3); ve (2) doğrudan çekirdeğe uygulanan niceliksel manyetik kuvvet (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6) tek başına CRISPR/Cas9 mühendisliği B2B hücrelerinde YAP N/C oranının çeşitli değişikliklerini tetikleyebilir (Şekil 7 ve Şekil 8).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05 % Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>156340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-&#181;m mean diameter carbonyl iron microbeads</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R confocal system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl Iron Powder CM</td>
			<td>BASF</td>
			<td>30042253</td>
			<td>Magnetic microbead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium (RPMI-1640)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td></td>
			<td>with Windows 10 operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental chamber TIZB</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>TIZB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom petri dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>K&#38;J Magnetics, Inc.</td>
			<td>D99-N52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome&#160;Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-70S7M-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements software platform</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleus mask ImageJ macro</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucSpot Live 650</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#40082</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti2-E inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYZ mover (CAD files)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining 3d magnetic force actuator and multi-functional fluorescence imaging to study nucleus mechanobiology

Mekanobiyolojide temel bir soru, canlı hücrelerin hücre fizyolojisi ve patolojisi bağlamında hücre dışı mekanik uyaranları nasıl algıladıklarıdır. Hücre dışı mekanik uyaranların hücresel mekano-hissinin membran reseptörleri, ilişkili protein kompleksi ve hücre iskeleti yoluyla olduğuna inanılmaktadır. Mekanobiyolojideki son gelişmeler, sitoplazmadaki hücre çekirdeğinin mekanik uyaranları aynı anda bağımsız olarak algılayabildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, hücre çekirdeğinin mekanik uyaranları nasıl algıladığına, dönüştürdüğüne ve tepki verdiğine dair mekanik bir anlayış, esas olarak geleneksel araçlarla çekirdek mekaniğine erişme ve ölçmedeki teknik zorluklar nedeniyle eksiktir. Bu yazıda, hücre çekirdeğini doğrudan deforme etmek için hassas ve invaziv olmayan 3D mekanik uyaranlar uygulayan yeni bir manyetik kuvvet aktüatörünün tasarımı, üretimi ve uygulanması açıklanmaktadır. CRISPR / Cas9 mühendisliği yapılmış hücreleri kullanan bu çalışma, bu aracın, yüksek çözünürlüklü konfokal floresan görüntüleme ile birleştiğinde, çekirdek deformasyonunun bir fonksiyonu olarak tek hücrelerde mekanoya duyarlı evet ile ilişkili bir proteinin (YAP) gerçek zamanlı dinamiklerinin ortaya çıkarılmasını sağladığını göstermektedir. Bu basit yöntem, mekanobiyoloji topluluğundaki mevcut teknoloji boşluğunu kapatma ve çekirdek mekanotransdüksiyonu ile hücre fonksiyonu arasındaki ilişkide var olan bilgi boşluğuna cevap verme potansiyeline sahiptir.

Mıknatıs hareket ettirici bir cihazın tasarımı ve manyetik kuvvet uygulaması Manyetik mikroboncuklar aracılığıyla çekirdeğe kuvvet uygulamak için, mıknatısın uzamsal konumunu kontrol etmek için mıknatıs hareket ettirici bir cihaz tasarlanmış ve üretilmiştir. Mıknatıs hareket ettiren cihaz, bağlı mıknatısı döngü başına 1,59 mm'lik uzamsal çözünürlükte bağımsız olarak x, y ve z yönlerinde hareket ettirmek için merkezi bir çerçeve, üç düğme ve raylar içe...

Watch this Scientific Journal Video about Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology at JoVE.com

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla hücre çekirdeğine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için yeni bir protokol sunmaktadır.

Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

Bu yöntemde, kuvvet doğrudan çekirdeğe uygulanır. Bu, kuvvet iletim etkisini hücre plazma zarından ve sitoiskeletten ayırır ve nükleer mekanosensingin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarır. Kuvvet, canlı hücreler içinde invaziv olmayan bir şekilde uygulanır.Optik cımbızla karşılaştırıldığında, manyetik alan ve manyetik kuvvet hücre fonksiyonlarını etkilemez ve daha yüksek verime sahiptir. Ortalama çapı yedi mikrometreye sahip 0.2 gram karbonil demir mikroboncuk tartarak hücreleri manyetik mikroboncuklarla kültürlemeye başlayın. Mikroboncukları bir pipet kullanarak bir mililitre RPMI 1640 kültür ortamında askıya alın.Daha sonra B2B hücreli Petri kabını biyogüvenlik kabinine alın ve Petri kabına mikroboncuk içeren ortamın 200 mikrolitresini hızla ekleyin. Petri kabını, mikroboncuklar hücreler tarafından içselleştirilene kadar bir inkübatöre koyun. Ters çevrilmiş mikroskobu açın ve konfokal floresan görüntülemeyi kullanarak, mikroboncuk, nükleer ve hücre sınırını görselleştirerek her altı saatte bir hücre hatlarının içselleştirilmesi için en uygun zamanı belirleyin.İçselleştirilmiş mikroboncuklar hücre sınırı içinde mevcut olacaktır. Küçük kuvvet uygulaması ve canlı hücre görüntüleme için, Elements yazılım uygulamasını açın. Yapılandırma manyetik bulgusunu tanımlamak için, tarama hızını iki saniyede bir kareye ayarlamak üzere ikiden fazla düğmeyi tıklatın.İğne deliği boyutunu 1,2 Havadar üniteye ayarlayın. Yalnızca FITC kanalını kontrol edin ve PMT HV'yi 70, ofset sıfır, lazer yoğunluğunu 10 olarak ayarlayın. Manyetik YAP çekirdeği yapılandırmasını tanımlamak için, dörtten fazla düğmeye tıklayarak tarama hızını dört saniyede bir kareye ayarlayın.Ardından, iğne deliği boyutunu 1.2 Havadar üniteye ayarlamak için 1.2 Havadar ünite düğmesine tıklayın ve FITC kanalını kontrol edin. PMT HV'yi 70, ofset sıfır, lazer yoğunluğunu 10 olarak ayarlayın. Çekirdek sınırını ve nükleer leke yoğunluğunu görüntülemek için, siyanin 5 kanalını kontrol edin.1.2 Havadar ünite düğmesine tıklamayın ve PMT HV'yi 70'e, ofset sıfıra ve lazer yoğunluğunu 10'a ayarlamayın. İğne deliği boyutu, üç boyutlu YES ile ilişkili protein görüntüleme için optimize edilecektir. Ardından, DIA'yı Elements aracılığıyla açın.Döndürme görünümünü açın, parlak bir alan kullanın ve hücrelerin net bir odak içi görüntüsünü elde etmek için nesnenin odağını ayarlayın. İçinde tek bir mikroboncuk bulunan, içinde birden fazla mikroboncuk bulunan ve içinde herhangi bir mikroboncuk bulunmayan bir hücre gibi üç koşulda uygun çoklu tek hücreleri bulmak için 10X hedefi kullanın. Ardından 40X hedefine geçin ve bu pozisyonu uygun pozisyon numarasıyla adlandırın.Elements'i açın, manyetik bul'a tıklayın, kilidi kaldırın, ardından sekmeleri tarayın, ardından seçilen hücrelerin Z yığını için alt ve üst sınırı ayarlamak üzere odak düzleminin Z konumunu ayarlamak için üst ve alt düğmeleri seçin. Tara'yı tekrar tıklatarak taramayı durdurun. Manyetik YAP çekirdek yapılandırmasına geçin ve dosya adını before_small_force.nd2 olarak ayarlayın.Kaydedilen Z yığını ile çalıştır düğmesine tıklayın. Sağ ışık yoluna geçin ve DIA'yı açın. spin görünümünü açın ve kayıt düğmesine tıklayın.Mıknatıs hareket ettirici cihazın düğmesini döndürerek mıknatısı Petri kabının tabanının 46 milimetre yukarısına getirin. Manyetik kuvvetin neden olduğu mikroboncuk yer değiştirmesini doğrulamak için videoyu kaydedin ve kontrol edin. Dosya adını after_small_force.nd2 olarak ayarlayarak tarama yordamını yineleyin.Ardından, sağ ışık yoluna geçin, DIA'yı açın ve kayıt düğmesine tıklamadan önce döndürme görünümünü açın. Mıknatıs hareket ettirici cihaz düğmesini Petri kabının altından 120 milimetreye kadar döndürün ve parlak alan görüntü dizisini veya videosunu kaydedin. Dosya adını before_large_force.nd2 olarak ayarlayarak tarama adımlarını yineleyin.Mikroboncuklar, FITC veya siyanin 5 kanalında lazer uyarımı altında floresan yayamazlar. Böylece, içselleştirilmiş mikroboncuklar, YES ile ilişkili protein ve çekirdeğin floresansının konfokal görüntülemesinde bulunan koyu oyukla tanımlanmıştır. Nükleer döngüsellik, kontrol hücreleri ile mikroboncuk içselleştirmeli hücreler arasında anlamlı bir fark göstermedi.Mikroboncukla birlikte kültürlenmiş ancak içselleştirme yapılmamış kontrol hücrelerinin YES ile ilişkili protein hücresi çekirdeği-sitoplazma oranı ve mikroboncuk içselleştirmeli hücreler de anlamlı bir fark göstermemiştir. Aktinin çekirdek deformasyonu ve depolimerizasyonu, sitoiskelet içeren hücrelerde mikroboncuklar tarafından uygulanan sıkıştırma kuvvetinden kaynaklanmıştır. Kantitatif AFM kuvvet yer değiştirme ilişkisi tarafından sağlanan kantitatif görüntüleme analizi kalibrasyon eğrisi.Bu ilişkiye dayanarak, boncukların uyguladığı kuvvet tahmin edildi. Çekirdek deformasyonu ve YES ile ilişkili protein translokasyonu, uygulama veya manyetik kuvvetin serbest bırakılması üzerine gözlendi. Yeşil kanaldaki YES ile ilişkili proteindeki yoğunluk değişiklikleri ve kırmızı kanaldaki çekirdek boyamasında hiçbir değişiklik olmaması, manyetik kuvvet kaynaklı nükleer deformasyonun YES ile ilişkili protein translokasyonu tarafından tetiklendiğini doğruladı.İki grup içinde YES ile ilişkili protein çekirdeği-sitoplazma oranının net değişiminin nicelleştirilmesi, sitoplazma içindeki mikroboncuklara uygulanan manyetik kuvvetin YES ile ilişkili protein translokasyonunu indüklediğini ve YES ile ilişkili protein çekirdeği-sitoplazma oranını değiştirdiğini doğruladı. Kuvvet ve görüntüleme uygulamadan önce, hücrelerin manyetik mikro boncukları içselleştirdiğinden ve boncukların hücre sınırı içinde olduğundan emin olun.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...