1.8K Views
•
07:51 min
•
June 16th, 2022
DOI :
June 16th, 2022
•0:05
Introduction
0:53
Intestinal Epithelial Cell Plating in Basement Membrane Matrix from Whole Specimens
2:54
Immunofluorescent Staining of the Enteroids
3:57
Preparation for Microinjection of Enteroids
6:13
Results: Visualization of Stained Enteroids
7:19
Conclusion
Transcript
Betydningen af denne protokol er at teste bruttosandsynligheden for enteroider på in vitro-model af for tidligt epitel. Den største fordel ved denne teknik er at måle permeabiliteten fra et lukket lumen, der efterligner tarmens luminale miljø. Denne protokol kan bruges til at studere de faktorer, der inducerer eller dæmper utæt tarmsygdom.
Det kan også anvendes på endotel- eller vaskulære systemer til at studere tilstande, der kan fremkalde vaskulær lækage. Denne protokol kræver en vis praksis. Vi anbefaler at øve hvert afsnit separat, før du sætter hele proceduren sammen.
Til at begynde med overføres tarmsegmenterne til en 60 x 15 kvadrat millimeter petriskål med iskold Dulbeccos PBS med amfoteracin og blødlægges i 20 minutter på is. Brug en skalpel med en saks til at skære tarmsegmenterne i tre til fem millimeter stykker og placere en til to stykker i en 35 x 15 kvadrat millimeter petriskål indeholdende 0,5 til en milliliter organoid vækstmedium på is. Skær tarmrøret i længderetningen ved hjælp af dissekering af mikrosaks og tang.
Brug derefter tangen til at skrabe epitelcellerne fra fasciaen. Fjern fasciaen og hvirvl skålen for at bryde celleklumperne. Derefter overføres cellerne og mediet i et trin på fem til 10 mikroliter til en kældermembranmatrixblanding ved hjælp af en 20-mikroliter pipetteskæringsspids for at fremstille en 285 mikroliter opløsning.
Bland cellerne ved at pipettere i en kældermembranmatrix på is ved hjælp af en 200 mikroliter skærespids. Efter blanding placeres fem 50 mikroliter strimler af cellekældermembranmatrixblandingen i en brønd af en forvarmet seks-brøndplade, der holdes på en varm skumsten. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 10 minutter for at tillade polymerisation og hærdning af kældermembranmatrixen.
Når matrixstrimlerne er størknet, tilsættes to milliliter af det enteroide vækstmedie i brønden, inden pladen sættes tilbage i inkubatoren. Efter overførsel af enteroiderne til en brønd af en seks-brønd eller 12-brøndplade, hver alternativ dag, udskift de gamle medier med friske medier. Og da enteroiderne er begyndt at trives, skal du passere cellerne hver femte til syv dage.
Til immunfluorescensfarvning tilsættes 500 mikroliter af det primære antistof i blokerende buffer til hver brønd af enteroider og inkuberes natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag fjernes antistofopløsningen og vaskes enteroiderne tre gange med PBS. Efter inkubation i en til 400 fortyndet sekundær antistofopløsning efterfulgt af inkubation i DAPI, vask enteroiderne tre gange med PBS.
For at bevare enteroidernes tredimensionelle strukturer skal du bruge udskæringer af tynde siliciumgummiplader eller glasdæksler for at skabe et mellemrum på 0,5 til en millimeter mellem bundglasglidet og dækslip. Til montering vaskes de farvede enteroider med 70% glycerol. Derefter løftes enteroiderne ud af pladen ved hjælp af en en-mikroliter podesløjfe eller en skåret 200 mikroliter spids og monteres med glycerol på et glasmikroskopglas.
Forbered en petriskål dækket med et gennemsigtigt filmdæksel og tilsæt to til fire en-mikroliter dråber Dextran-FITC på filmen. Brug mikromanipulatoren til at køre mikropipettespidsen inde i væsken og over filmen under et stereomikroskop, og træk derefter forsigtigt sprøjten for at trække Dextran-FITC ind i mikropipetten. Når du har fyldt mikropipetten med to til fire mikroliter Dextran-FITC, skal du skubbe sprøjten for at fjerne luft fra pipettespidsen.
Undersøg også den injicerede materialesøjle i mikropipetten for at sikre, at der ikke er nogen luftlomme, og registrer mængden af Dextran-FITC inde i mikropipetten. Tænd derefter for luftkilden, der er tilsluttet den pneumatiske pumpe, før du tænder pumpen, og indstil pumpens varighed til 10 til 15 millisekunder. Drej derefter stophanen på sprøjten for at åbne ledningen fra pumpen til mikropipetten.
Fjern enteroiderne fra inkubatoren og læg skålen på en varm skumsten i en overdækket beholder for at minimere lyseksponering efter mikroinjektion. Placer petriskålen med enteroider under stereomikroskopet, og flyt mikromanipulatorknapperne for at placere mikropipettespidsen i en vinkel på 35 til 45 grader til den vandrette overflade. Visualiser og identificer de sfæriske enteroider med et mål om at injicere tre til fem enteroider pr. Skål.
Fremskynd derefter spidsen til et mål enteroid ved at se gennem mikroskopet øjenstykker. Derefter fremrykker Z-akseknappen med en præcis langsom bevægelse, og punkterer enteroiden med mikropipettespidsen. Fremskridtet skal stoppe, når spidsen går gennem den enteroide overflade, som deprimeres og springer tilbage.
Tryk på pumpepedalen med den ene fod, og fyld enteroiden med den grønlige Dextran-FITC-opløsning, indtil den er udvidet. Registrer antallet af pumper for at beregne det pumpede volumen og Dextran-koncentrationen. Denne protokol viste karakteriseringen af fostervævsafledte enteroider ved farvning af forskellige biomarkører, der er specifikke for tarmepitel med immunfluorescerende antistoffer, hvilket bekræfter deres tyndtarmepiteloprindelse.
Enteroider på forskellige stadier vises her. En syv til 10 dage gammel enteroid er lille og tyk. Mens en enteroid klar til mikroinjektion var stor med lumen og tynd væg.
Enteroiden to dage efter mikroinjektionen indeholder stadig betydelige mængder Dextran-FITC. Enteroidernes permeabilitet efter mikroinjektion blev vurderet ved at måle Dextran-koncentrationen i mediet. EGTA, der er kendt for at øge membranpermeabiliteten ved tætte kryds, blev brugt som en positiv kontrol.
Dextran-måleanalysen viser yderligere, at LPS inducerede øget permeabilitet og højere LPS-koncentration inducerede højere permeabilitet. Det vigtigste ved fastgørelse og farvning er ikke at forstyrre formen på enteroiderne eller at miste dem under processen. Efter mikroinjektion kan medier indsamles til cytokinassay, og enteroider kan høstes til RNA-sekventering.
Denne protokol beskriver etableringen af enteroider, en tredimensionel tarmmodel, fra føtal tarmvæv. Immunofluorescerende billeddannelse af epitelbiomarkører blev brugt til modelkarakterisering. Apikal eksponering af lipopolysaccharider, et bakterielt endotoksin, ved hjælp af mikroinjektionsteknik induceret epitelpermeabilitet på en dosisafhængig måde målt ved lækage af fluorescerende dextran.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved