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June 16th, 2022
DOI :
June 16th, 2022
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Introduction
0:53
Intestinal Epithelial Cell Plating in Basement Membrane Matrix from Whole Specimens
2:54
Immunofluorescent Staining of the Enteroids
3:57
Preparation for Microinjection of Enteroids
6:13
Results: Visualization of Stained Enteroids
7:19
Conclusion
Transcript
इस प्रोटोकॉल का महत्व समय से पहले उपकला के इन विट्रो मॉडल पर एंटरोइड्स की सकल संभावना का परीक्षण करना है। इस तकनीक का मुख्य लाभ एक संलग्न लुमेन से पारगम्यता को मापना है जो आंत ल्यूमिनल वातावरण की नकल करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग उन कारकों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो लीक आंत रोग को प्रेरित या क्षीण करते हैं।
यह एंडोथेलियल या संवहनी प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है ताकि उन स्थितियों का अध्ययन किया जा सके जो संवहनी रिसाव को प्रेरित कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता है। हम पूरी प्रक्रिया को एक साथ रखने से पहले प्रत्येक अनुभाग का अलग-अलग अभ्यास करने की सलाह देते हैं।
शुरू करने के लिए, आंत के खंडों को 60 से 15 वर्ग मिलीमीटर पेट्री डिश में बर्फ-ठंडा डुलबेको के पीबीएस के साथ एम्फोटेरेसिन के साथ स्थानांतरित करें और बर्फ पर 20 मिनट के लिए भिगोएं। कैंची की एक जोड़ी के साथ एक स्केलपेल का उपयोग करके, आंत के खंडों को तीन से पांच मिलीमीटर टुकड़ों में काटें और बर्फ पर 0.5 से एक मिलीलीटर ऑर्गेनोइड विकास माध्यम वाले 35 से 15 वर्ग मिलीमीटर पेट्री डिश में एक से दो टुकड़े रखें। आंतों की ट्यूब को सूक्ष्म कैंची और बल का उपयोग करके अनुदैर्ध्य रूप से काटें।
फिर प्रावरणी से उपकला कोशिकाओं को खुरचने के लिए बल का उपयोग करें। प्रावरणी को हटा दें और सेल के झुरमुट को तोड़ने के लिए पकवान को घुमाएं। फिर, 20-माइक्रोलीटर पिपेट कट टिप का उपयोग करके, कोशिकाओं और मीडिया को 285-माइक्रोलीटर समाधान बनाने के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण में पांच से 10 माइक्रोलीटर की वृद्धि पर स्थानांतरित करें।
200-माइक्रोलीटर कट टिप का उपयोग करके बर्फ पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में पाइपिंग करके कोशिकाओं को मिलाएं। मिश्रण के बाद, सेल बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मिश्रण के पांच 50-माइक्रोलीटर स्ट्रिप्स को गर्म फोम ईंट पर रखे पूर्व-गर्म छह-वेल प्लेट के एक कुएं में रखें। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर प्लेट को इनक्यूबेट करें ताकि पोलीमराइजेशन और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स को सख्त किया जा सके।
एक बार मैट्रिक्स स्ट्रिप्स जम जाने के बाद, प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस डालने से पहले कुएं में एंटरॉइड ग्रोथ मीडिया के दो मिलीलीटर जोड़ें। एंटरोइड्स को छह-वेल या 12-वेल प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करने के बाद, हर दूसरे दिन, पुराने मीडिया को ताजा मीडिया से बदलें। और जैसा कि एंटरोइड्स ने पनपना शुरू कर दिया है, कोशिकाओं को हर पांच से सात दिनों में पारित करें।
इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए, एंटरोइड्स के प्रत्येक कुएं में बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और पीबीएस के साथ एंटरोइड्स को तीन बार धोएं। एक से 400 पतला द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेशन के बाद, डीएपीआई में इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस के साथ एंटरोइड्स को तीन बार धोएं।
एंटरोइड्स की त्रि-आयामी संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए, नीचे ग्लास स्लाइड और कवर स्लिप के बीच 0.5 से एक मिलीमीटर की जगह बनाने के लिए पतली सिलिकॉन रबर शीट या ग्लास कवर स्लिप के कटआउट का उपयोग करें। माउंटिंग के लिए, दाग वाले एंटरोइड्स को 70% ग्लिसरॉल के साथ धोएं। फिर, एक-माइक्रोलीटर इनोकुलेटिंग लूप, या कट 200-माइक्रोलीटर टिप का उपयोग करके, एंटरोइड्स को प्लेट से बाहर उठाएं और ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ग्लिसरॉल के साथ माउंट करें।
एक पारदर्शी फिल्म कवर के साथ कवर की गई पेट्री डिश तैयार करें और फिल्म पर डेक्सट्रान-एफआईटीसी की दो से चार एक-माइक्रोलीटर बूंदें जोड़ें। माइक्रो मैनिपुलेटर का उपयोग करके, माइक्रो पिपेट टिप को तरल के अंदर और फिल्म के ऊपर स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत ड्राइव करें, फिर माइक्रो पिपेट में डेक्सट्रान-एफआईटीसी को वापस लेने के लिए धीरे से सिरिंज खींचें। डेक्सट्रान-एफआईटीसी के दो से चार माइक्रोलीटर के साथ माइक्रो पिपेट भरने के बाद, पिपेट टिप से किसी भी हवा को हटाने के लिए सिरिंज को धक्का दें।
इसके अलावा, माइक्रो पिपेट में इंजेक्शन सामग्री कॉलम का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई एयर पॉकेट नहीं है और माइक्रो पिपेट के अंदर डेक्सट्रान-एफआईटीसी की मात्रा रिकॉर्ड करें। इसके बाद, पंप को चालू करने से पहले वायवीय पंप से जुड़े वायु स्रोत को चालू करें और पंप की अवधि 10 से 15 मिलीसेकंड तक सेट करें। फिर पंप से माइक्रो पिपेट तक लाइन खोलने के लिए स्टॉपकॉक को सिरिंज पर घुमाएं।
इनक्यूबेटर से एंटरोइड्स को हटा दें और माइक्रो-इंजेक्शन के बाद प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए डिश को एक कवर कंटेनर में गर्म फोम ईंट पर रखें। पेट्री डिश को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे एंटरोइड्स के साथ रखें और माइक्रो पिपेट टिप को क्षैतिज सतह पर 35-से 45-डिग्री कोण पर रखने के लिए माइक्रो मैनिपुलेटर नॉब्स को स्थानांतरित करें। प्रति डिश तीन से पांच एंटरोइड्स को इंजेक्ट करने के लक्ष्य के साथ गोलाकार एंटरोइड्स की कल्पना और पहचान करें।
इसके बाद, माइक्रोस्कोप आंखों के टुकड़ों के माध्यम से देखकर टिप को एक लक्ष्य एंटरॉइड तक अग्रिम करें। फिर, जेड-अक्ष नॉब को एक सटीक धीमी गति के साथ आगे बढ़ाते हुए, माइक्रो पिपेट टिप के साथ एंटरॉइड को पंचर करें। एक बार जब नोक एंटरॉइड सतह से गुजरती है, तो प्रगति बंद हो जानी चाहिए, जो उदास हो जाती है और वापस आ जाती है।
एक पैर से पंप पेडल पर टैप करें और विस्तारित होने तक हरे रंग के डेक्सट्रान-एफआईटीसी समाधान के साथ एंटरॉइड भरें। पंप की मात्रा और डेक्सट्रान एकाग्रता की गणना करने के लिए पंपों की संख्या रिकॉर्ड करें। इस प्रोटोकॉल ने इम्यूनोफ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ आंतों के उपकला के लिए विशिष्ट विभिन्न बायोमाकर्स को धुंधला करके भ्रूण के ऊतक-व्युत्पन्न एंटरोइड्स के लक्षण वर्णन को दिखाया, जिससे उनकी छोटी आंत उपकला उत्पत्ति की पुष्टि हुई।
विभिन्न चरणों में एंटरोइड्स यहां दिखाए गए हैं। सात से 10 दिन का एंटरॉइड छोटा और मोटा होता है। जबकि माइक्रो-इंजेक्शन के लिए तैयार एक एंटरॉइड एक लुमेन और पतली दीवार के साथ बड़ा था।
माइक्रो-इंजेक्शन के दो दिन बाद एंटरॉइड में अभी भी डेक्सट्रान-एफआईटीसी की महत्वपूर्ण मात्रा होती है। माइक्रो-इंजेक्शन के बाद एंटरोइड्स की पारगम्यता का मूल्यांकन मीडिया में डेक्सट्रान एकाग्रता को मापकर किया गया था। ईजीटीए, तंग जंक्शनों पर झिल्ली पारगम्यता बढ़ाने के लिए जाना जाता है, का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था।
डेक्सट्रान माप परख आगे बताती है कि एलपीएस ने बढ़ी हुई पारगम्यता को प्रेरित किया और उच्च एलपीएस एकाग्रता ने उच्च पारगम्यता को प्रेरित किया। फिक्सिंग और धुंधला होने के बारे में सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि एंटरोइड्स के आकार को बाधित न करें या प्रक्रिया के दौरान उन्हें खो दें। माइक्रो-इंजेक्शन के बाद, मीडिया को साइटोकिन परख के लिए एकत्र किया जा सकता है और आरएनए अनुक्रमण के लिए एंटरोइड्स को काटा जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल भ्रूण आंतों के ऊतकों से एक त्रि-आयामी आंतों के मॉडल, एंटरोइड्स की स्थापना का विवरण देता है। मॉडल लक्षण वर्णन के लिए उपकला बायोमार्कर के इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग किया गया था। फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के रिसाव द्वारा मापी गई खुराक-निर्भर तरीके से माइक्रोइंजेक्शन तकनीक का उपयोग करके लिपोपॉलेसेकेराइड, एक जीवाणु एंडोटॉक्सिन का एपिकल एक्सपोजर एपिथेलियल पारगम्यता को प्रेरित करता है।
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