이 프로토콜의 중요성은 조기 상피의 시험관 내 모델에서 엔테로이드의 총 확률을 테스트하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 장 내강 환경을 모방 한 밀폐 된 루멘으로부터 투과성을 측정하는 것입니다. 이 프로토콜은 새는 장 질환을 유발하거나 약화시키는 요인을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
또한 혈관 누출을 유도 할 수있는 상태를 연구하기 위해 내피 또는 혈관 시스템에 적용 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 약간의 연습이 필요합니다. 전체 절차를 통합하기 전에 각 섹션을 개별적으로 연습하는 것이 좋습니다.
시작하려면 장 세그먼트를 암포 테라 신이 함유 된 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 PBS와 함께 60 x 15 평방 밀리미터의 페트리 접시로 옮기고 얼음에 20 분 동안 담그십시오. 한 쌍의 가위로 메스를 사용하여 장 세그먼트를 3-5 밀리미터 조각으로 자르고 얼음 위에 0.5-1 밀리리터의 오가노이드 성장 배지가 들어있는 35 x 15 평방 밀리미터의 페트리 접시에 1-2 개를 놓습니다. 해부 마이크로 가위와 집게를 사용하여 장 튜브를 세로로 자릅니다.
그런 다음 집게를 사용하여 근막에서 상피 세포를 긁어냅니다. 근막을 제거하고 접시를 소용돌이 치면 세포 덩어리가 끊어집니다. 그런 다음 20마이크로리터 피펫 절단 팁을 사용하여 세포와 배지를 5 내지 10마이크로리터 단위로 기저막 매트릭스 믹스로 옮겨 285마이크로리터 용액을 만듭니다.
200마이크로리터 절단 팁을 사용하여 얼음 위의 기저막 매트릭스에서 피펫팅하여 세포를 혼합합니다. 혼합 후, 따뜻한 발포 벽돌 위에 유지된 예열된 6웰 플레이트의 한 웰에 세포 기저막 매트릭스 믹스의 50마이크로리터 스트립 5개를 놓습니다. 플레이트를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 10분 동안 배양하여 중합 및 기저막 매트릭스의 경화를 허용합니다.
매트릭스 스트립이 응고되면 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣기 전에 2 밀리리터의 장내 성장 배지를 웰에 추가합니다. 엔터 로이드를 6 웰 또는 12 웰 플레이트의 웰로 옮긴 후 격일마다 기존 미디어를 새 미디어로 교체하십시오. 그리고 엔테로이드가 번성하기 시작하면 5-7 일마다 세포를 통과시킵니다.
면역형광 염색을 위해 블로킹 완충액에 500마이크로리터의 1차 항체를 각 엔테로이드 웰에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 항체 용액을 제거하고 PBS로 엔테로이드를 세 번 세척한다. 1 내지 400 희석된 2차 항체 용액에서 인큐베이션한 후, DAPI에서 인큐베이션한 후, 엔테로이드를 PBS로 3회 세척하였다.
엔터 로이드의 3 차원 구조를 보존하려면 얇은 실리콘 고무 시트 또는 유리 커버 슬립의 컷 아웃을 사용하여 하단 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 0.5-1 밀리미터의 공간을 만듭니다. 장착을 위해 염색 된 엔터 로이드를 70 % 글리세롤로 씻으십시오. 그런 다음 1 마이크로 리터 접종 루프 또는 절단 된 200 마이크로 리터 팁을 사용하여 엔터 로이드를 플레이트에서 들어 올리고 글리세롤로 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.
투명 필름 커버로 덮인 페트리 접시를 준비하고 필름에 Dextran-FITC를 2-4 개의 1 마이크로 리터 방울 떨어 뜨립니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로 피펫 팁을 실체 현미경으로 액체 내부와 필름 위로 구동한 다음 주사기를 부드럽게 당겨 Dextran-FITC를 마이크로 피펫으로 빼냅니다. 마이크로 피펫에 2-4 마이크로리터의 Dextran-FITC를 채운 후 주사기를 밀어 피펫 팁에서 공기를 제거합니다.
또한 마이크로 피펫에 주입된 물질 컬럼을 검사하여 에어 포켓이 없는지 확인하고 마이크로 피펫 내부의 Dextran-FITC의 부피를 기록합니다. 그런 다음 펌프를 켜고 펌프 지속 시간을 10-15 밀리 초로 설정하기 전에 공압 펌프에 연결된 공기 공급원을 켜십시오. 그런 다음 주사기의 스톱 콕을 돌려 펌프에서 마이크로 피펫까지의 라인을 엽니 다.
인큐베이터에서 엔테로이드를 제거하고 마이크로 주입 후 빛 노출을 최소화하기 위해 덮인 용기의 따뜻한 거품 벽돌 위에 접시를 놓습니다. 엔테로이드가 있는 페트리 접시를 실체 현미경 아래에 놓고 마이크로 매니퓰레이터 손잡이를 움직여 마이크로 피펫 팁을 수평 표면에 대해 35-45도 각도로 놓습니다. 접시 당 3-5 개의 엔터 로이드를 주입하는 목표로 구형 엔터 로이드를 시각화하고 식별합니다.
다음으로, 현미경 아이피스를 통해 보고 팁을 대상 엔터로이드로 전진시킵니다. 그런 다음 Z축 손잡이를 정확하고 느린 움직임으로 전진시키고 마이크로 피펫 팁으로 엔터로이드에 구멍을 뚫습니다. 팁이 장내 표면을 통과하면 전진이 멈춰야 하며, 이는 눌리고 다시 튀어나옵니다.
한 발로 펌프 페달을 두드리고 팽창 될 때까지 녹색 Dextran-FITC 용액으로 엔터 로이드를 채 웁니다. 펌핑 된 부피와 덱스 트란 농도를 계산하기 위해 펌프 수를 기록하십시오. 이 프로토콜은 장 상피에 특이적인 다양한 바이오마커를 면역형광항체로 염색하여 소장 상피 기원을 확인하여 태아 조직 유래 엔테로이드의 특성을 보여주었습니다.
다른 단계의 엔터 로이드가 여기에 표시됩니다. 7-10 일 된 장내 장은 작고 두껍습니다. 마이크로 주입을 위해 준비된 엔터 로이드는 루멘과 얇은 벽으로 컸습니다.
마이크로 주사 후 2 일 동안 장형은 여전히 상당한 양의 덱스 트란 -FITC를 함유하고 있습니다. 마이크로 주입 후 엔테로이드의 투과성은 배지 중의 덱스트란 농도를 측정하여 평가하였다. 단단한 접합부에서 막 투과성을 증가시키는 것으로 알려진 EGTA가 양성 대조군으로 사용되었습니다.
덱스 트란 측정 분석은 LPS가 증가 된 투과성을 유도하고 LPS 농도가 높을수록 더 높은 투과성을 유도한다는 것을 보여줍니다. 고정 및 염색에서 가장 중요한 것은 엔터로이드의 모양을 방해하거나 공정 중에 엔터로이드를 잃지 않는 것입니다. 마이크로 주입 후, 사이토카인 분석을 위해 배지를 수집할 수 있고, RNA 시퀀싱을 위해 엔테로이드를 수확할 수 있습니다.
