1.8K Views
•
07:51 min
•
June 16th, 2022
DOI :
June 16th, 2022
•0:05
Introduction
0:53
Intestinal Epithelial Cell Plating in Basement Membrane Matrix from Whole Specimens
2:54
Immunofluorescent Staining of the Enteroids
3:57
Preparation for Microinjection of Enteroids
6:13
Results: Visualization of Stained Enteroids
7:19
Conclusion
Transcript
Betydningen av denne protokollen er å teste bruttosannsynligheten for enteroider på in vitro-modellen av for tidlig epitel. Den største fordelen med denne teknikken er å måle permeabiliteten fra et lukket lumen som etterligner tarmens luminale miljø. Denne protokollen kan brukes til å studere faktorene som induserer eller demper lekk tarmsykdom.
Det kan også brukes på endotel- eller vaskulære systemer for å studere forhold som kan indusere vaskulær lekkasje. Denne protokollen krever litt øvelse. Vi anbefaler at du praktiserer hver seksjon separat før du setter sammen hele prosedyren.
For å begynne med, overfør tarmsegmentene til en 60 x 15 kvadratmillimeter petriskål med iskald Dulbeccos PBS med amfoteracin og suge i 20 minutter på is. Bruk en skalpell med en saks, kutt tarmsegmentene i tre til fem millimeter stykker og legg en til to stykker i en 35 x 15 kvadratmillimeter petriskål som inneholder 0,5 til en milliliter organoid vekstmedium på is. Klipp tarmrøret i lengderetningen ved hjelp av dissekere mikrosaks og tang.
Bruk deretter tangen til å skrape epitelcellene fra fascia. Fjern fascia og virvle parabolen for å bryte celleklumpene. Deretter, ved hjelp av en 20-mikroliter pipetteskåret spiss, overfør cellene og media i en økning på fem til 10 mikroliter til en kjellermembranmatriseblanding for å lage en 285-mikroliter løsning.
Bland cellene ved pipettering i en kjellermembranmatrise på is ved hjelp av en 200 mikroliter kuttspiss. Etter blanding, legg fem 50-mikroliter strimler av celle kjellermembranmatriseblandingen i en brønn av en forvarmet seksbrønnsplate holdt på en varm skumstein. Inkuber platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 10 minutter for å tillate polymerisering og herding av kjellermembranmatrisen.
Når matrisestrimlene er størknet, tilsett to milliliter av enteroidvekstmediet i brønnen før du setter platen tilbake i inkubatoren. Etter å ha overført enteroider til en brønn på en seks-brønns eller 12-brønns plate, hver annen dag, erstatt det gamle mediet med friske medier. Og som enteroider har begynt å trives, passere cellene hver femte til syv dager.
For immunfluorescensfarging, tilsett 500 mikroliter av det primære antistoffet i blokkeringsbuffer til hver brønn av enteroider og inkuber over natten ved fire grader Celsius. Neste dag, fjern antistoffoppløsningen og vask enteroider tre ganger med PBS. Etter inkubasjon i en til 400 fortynnet sekundær antistoffløsning, etterfulgt av inkubasjon i DAPI, vask enteroidene tre ganger med PBS.
For å bevare de tredimensjonale strukturene til enteroidene, bruk utskjæringer av tynne silisiumgummiplater eller glassdekselsklier for å skape et 0,5 til en millimeter mellomrom mellom det nederste glassglasset og dekselet. For montering, vask de fargede enteroider med 70% glyserol. Deretter, ved hjelp av en mikroliter inokuleringssløyfe, eller en kuttet 200-mikroliter spiss, løft enteroidene ut av platen og monter med glyserol på et glassmikroskopglass.
Forbered en petriskål dekket med et gjennomsiktig filmdeksel og tilsett to til fire en-mikroliter dråper av Dextran-FITC på filmen. Bruk mikromanipulatoren til å kjøre mikropipettespissen inne i væsken og over filmen under et stereomikroskop, og trekk deretter sprøyten forsiktig for å trekke Dextran-FITC forsiktig inn i mikropipetten. Etter å ha fylt mikropipetten med to til fire mikroliter Dextran-FITC, skyv sprøyten for å fjerne luft fra pipettespissen.
Inspiser også kolonnen for injisert materiale i mikropipetten for å sikre at ingen luftlomme og registrer volumet av Dextran-FITC inne i mikropipetten. Deretter slår du på luftkilden som er koblet til den pneumatiske pumpen før du slår på pumpen og setter pumpens varighet til 10 til 15 millisekunder. Vri deretter stoppekranen på sprøyten for å åpne linjen fra pumpen til mikropipetten.
Fjern enteroider fra inkubatoren og legg parabolen på en varm skumstein i en dekket beholder for å minimere lyseksponering etter mikroinjeksjon. Plasser petriskålen med enteroider under stereomikroskopet og flytt mikromanipulatorknappene for å plassere mikropipettespissen i en 35 til 45 graders vinkel mot den horisontale overflaten. Visualiser og identifiser de sfæriske enteroidene med et mål om å injisere tre til fem enteroider per tallerken.
Deretter går du videre til et mål enteroid ved å se gjennom mikroskopets øyestykker. Deretter skyver du Z-akseknappen med en presis langsom bevegelse, punkterer enteroiden med mikropipettespissen. Fremgangen skal stoppe når spissen går gjennom enteroidoverflaten, som presser ned og spretter tilbake.
Trykk på pumpepedalen med en fot og fyll enteroiden med den grønnaktige Dextran-FITC-løsningen til den utvides. Registrer antall pumper for å beregne pumpet volum og Dextran-konsentrasjon. Denne protokollen viste karakterisering av fostervevsavledede enteroider ved å fargelegge forskjellige biomarkører som er spesifikke for tarmepitel med immunfluorescerende antistoffer, og bekreftet deres tynntarmepitelopprinnelse.
Enteroider på forskjellige stadier vises her. En syv til 10 dager gammel enteroid er liten og tykk. Mens en enteroid klar for mikroinjeksjon var stor med lumen og tynn vegg.
Enteroiden to dager etter mikroinjeksjonen inneholder fortsatt betydelige mengder Dextran-FITC. Permeabiliteten til enteroidene etter mikroinjeksjon ble vurdert ved å måle Dextran-konsentrasjonen i media. EGTA, kjent for å øke membranpermeabiliteten ved tette kryss, ble brukt som en positiv kontroll.
Dextran-måleanalysen viser videre at LPS induserte økt permeabilitet og høyere LPS-konsentrasjon induserte høyere permeabilitet. Det viktigste med festing og farging er ikke å forstyrre formen på enteroider eller å miste dem under prosessen. Etter mikroinjeksjon kan media samles for cytokinanalyse og enteroider kan høstes for RNA-sekvensering.
Denne protokollen beskriver etableringen av enteroider, en tredimensjonal tarmmodell, fra fosterets tarmvev. Immunfluorescerende avbildning av epitelbiomarkører ble brukt til modellkarakterisering. Apikal eksponering av lipopolysakkarider, et bakterielt endotoksin, ved bruk av mikroinjeksjonsteknikk induserte epitelpermeabilitet på en doseavhengig måte målt ved lekkasje av fluorescerende dextran.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved