يتيح بروتوكولنا التصوير المتزامن لديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة. يمكن تطبيقه على نطاق واسع للتحقيق في سلوك مراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة أو التفاعل مع الخلايا العصبية. ميزة هذه الطريقة هي أن القطع الأثرية المتحركة لا تلوث بيانات التصوير بسهولة بسبب التثبيت القوي للرأس.
أيضا ، تسمح لنا الاستعادة بعد التصوير بمعدل الإطارات المرتفع بإزالة قطعة أثرية متحركة من البيانات. في هذه الطريقة ، فإن حقن AAV وجراحة زرع نافذة الجمجمة تتطلب تقنيا. الفشل شائع في البداية ، لذا من فضلك لا تشعر بالإحباط وتدرب أكثر.
لتحضير جهاز الحقن ، ضع ماصة زجاجية متصلة بحقنة هاملتون قياس 26 من خلال أنبوب على حامل ماصة لأداة مجسمة. ثم قم بإمالة حامل الماصة 60 درجة أمامية من المحور الرأسي. املأ الماصة الزجاجية والمحقنة وأنبوب التوصيل بالبارافين السائل وضع المحقنة على حاقن دقيق.
إدارة تسكين للفأر المخدر وإرفاق قضبان الأذن المساعدة. ثم ، ثبت الحيوان على أداة التجسيم مع جانبها الظهري لأعلى. بعد إزالة الشعر من موقع الجراحة وتطهير المنطقة الجراحية ، قم بعمل شق بطول سنتيمترين على فروة الرأس على طول خط الوسط ، مما يضمن تعرضا جيدا للجمجمة فوق القشرة البصرية الأولية اليمنى.
استخدم ملقط لإزالة السمحاق على الجمجمة المكشوفة. حفر الجمجمة على إحداثيات التجسيمية ثلاثة ملليمترات جانبية إلى خط الوسط و 5 ملليلتر الأمامي لخط لامدا لإنشاء ثقب صغير يبلغ قطره حوالي 0.5 ملم. ثم ضع قطعة من الفيلم الشفاف حوالي سنتيمترين في سنتيمترين على الجمجمة المكشوفة للماوس.
طرد ميكرولتر واحد من قطرة محلول AAV على الفيلم باستخدام ماص. تقدم المحقنة. ضع طرف ماصة زجاجي في قطرة محلول AAV على الفيلم واسحب المحقنة برفق لشفط محلول AAV.
بعد ذلك ، أدخل ماصة الزجاج على عمق 500 ميكرومتر من سطح الدماغ من خلال الفتحة التي تم إنشاؤها في الجمجمة. بعد ذلك ، قم بحقن 0.5 ميكرولتر من محلول AAV باستخدام الحاقن الدقيق بمعدل تدفق حجم حقن يبلغ 2 ميكرولتر في الساعة. اسحب الإبرة وشطف سطح الدماغ بالمحلول الملحي.
إنشاء أخدود دائري على طول العلامة على الجمجمة عن طريق الحفر. نظف الحطام لضمان رؤية الجمجمة وتطبيق محلول ملحي لمنع التسخين أثناء الحفر. اضغط برفق على الجمجمة المركزية بالملقط.
عمق الحفر كاف إذا تحرك عموديا مع مقاومة قليلة. عندما يصل الأخدود إلى عمق كاف ، أدخل طرف الملقط في الجزء السفلي من جزء الجمجمة المركزي. ارفعه برفق وقم بإزالته لكشف سطح الدماغ.
باستخدام إبرة قياس 27 ، وخز وتمزيق الجافية على حافة سطح الدماغ المكشوف. أدخل طرف الملقط من خلال الفتحة الموجودة على حافة الجافية وقشرها لكشف سطح الدماغ. بعد تشتيت ألياف مرقئ واحدة تلو الأخرى في محلول ملحي ، ضع ألياف مرقئ على طول حواف الفتحة التي يوجد فيها الجافية المعبرة.
ضع نافذة الجمجمة على سطح الدماغ المكشوف ثم ألصقها بالجمجمة بالغراء الفوري مع الضغط برفق على النافذة. بعد ذلك ، ضع الغراء الفوري على الجمجمة المكشوفة بأكملها. بعد ذلك ، قم بتوصيل لوحة رأس بعناية على الجمجمة لتحديد نافذة الجمجمة في وسط الفتحة المربعة للوحة الرأس.
بمجرد أن يصلب الغراء بشكل كاف ، ضع أسمنت الأسنان على الجمجمة المكشوفة لتعزيز الارتباط بين الرأس وشفرة الرأس. لتثبيت جهاز التظليل المخصص وشاشة LCD للتحفيز البصري ، ضع العدسة أولا للتركيز على سطح الدماغ ثم قم بتعيين موضع العدسة هذا كموضع Z الأصلي. حافظ على إحداثيات XY ثابتة وارفع العدسة الموضوعية.
قم بإزالة الماوس والأداة المجسمة من العدسة الموضوعية. قم بتوصيل جهاز تظليل أعلى لوحة الرأس باستخدام السيليكون ، مع التأكد من أن المسافة بين لوحة الرأس وجهاز التظليل محكمة الغلق. املأ جهاز التظليل بالماء المقطر.
ثم ، قم بإصلاح الماوس باستخدام الإطار التجسيمي تحت العدسة الموضوعية. أعد ضبط المستوى البؤري بعناية على سطح الدماغ ، وتحقق من عمق العدسة الموضوعية. قم بتغطية العدسة الموضوعية بورق الألمنيوم الأسود لتجنب تلوث الضوء من شاشة LCD.
اضبط شاشة LCD مقاس 10 بوصات على ارتفاع 12.5 سم أمام أعين الماوس لتقديم محفزات بصرية. قم بتكوين مرشحات مجموعة تقديم الفلورسنت ل EGFP و R-CaMP والطول الموجي للإثارة إلى 1،000 نانومتر. احصل على صور بدقة مكانية تبلغ 0.25 ميكرون لكل بكسل.
ابحث عن منطقة التصوير حيث يمكن تصوير الخلايا العصبية الإيجابية R-CaMP والخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية EGFP في وقت واحد. في الطبقة 2 ، 3. احصل على صور بمعدل إطارات 30 هرتز.
بالتزامن مع التقاط الصورة ، قدم محفزات بصرية صريف الانجراف إلى الماوس في 12 اتجاها في ستة اتجاهات ، من صفر إلى 150 درجة في خطوات 30 درجة. بعد الحصول على الصورة ، قم بإزالة الماوس من مرحلة المجهر. افصل جهاز التظليل وأداة التجسيم عن الماوس ، وأعد الماوس إلى قفصه الرئيسي.
باستخدام هذا البروتوكول ، تم إجراء حقن AAV وزرع نافذة الجمجمة في القشرة البصرية الأولية لفأر معدل وراثيا عمره ثمانية أسابيع ، تلاه تصويران فوتونيان للنشاط العصبي القائم على R-CaMP وديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في الطبقة 2 ، 3. تم تقديم المحفزات البصرية الشبكية للفأر وتم تحليل الاستجابات البصرية في العمود الفقري الزدري باستخدام آثار الكالسيوم. أظهرت العمليات الدبقية الصغيرة ديناميكيات سريعة وغيرت مورفولوجيتها في غضون 10 ثوان.
باستخدام التصوير ثنائي الفوتون في الطبقة 2 ، 3 من القشرة البصرية الأولية في فأر معدل وراثيا عمره 12 أسبوعا ، لوحظ R-CaMP في الخلايا العصبية ، كما هو موضح هنا في اللون الأرجواني. لوحظ EGFP في الخلايا الدبقية الصغيرة ، شوهد باللون الأخضر. كما لوحظت إشارات فردية ل EGFP و R-CaMP.
يعد حقن AAV الناجح أمرا بالغ الأهمية لهذه الطريقة. الأسباب الرئيسية لفشل حقن AAV هي الماصات الزجاجية على مدار الساعة وتلف الأنسجة. تم تحديد سلوك المراقبة على الخلايا الدبقية الصغيرة وتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة في SNAP لتكون سائدة في آليات مسببة للأمراض المختلفة ، مثل مرض الزهايمر.
طريقتنا مفيدة للبحث الذي يركز على هذا المجال.
