Name: development of knock-out muscle cell lines using lentivirus-mediated crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dell'Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) e dell'Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Le biopsie muscolari sono state ottenute dalla Banca dei tessuti per la ricerca (Myobank, partner della rete UE EuroBioBank, Parigi, Francia) in conformità con le raccomandazioni europee e la legislazione francese. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti gli individui. I mioblasti immortalati sono stati gentilmente prodotti dal Dr. V. Mouly (Istituto di Miologia, Parigi, Francia) e i protocolli sono stati approvati dal comitato etico dell'Istituto di Miologia (MESRI, n AC-2019-3502).
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Un passo importante sulla strada verso la caratterizzazione di geni di funzione sconosciuta coinvolti in patologie è lo sviluppo di modelli cellulari rilevanti per studiare la funzione di questi geni. L'uso dell'editing genetico utilizzando CRISPR / Cas9 è un campo di ricerca in crescita esponenziale e lo sviluppo di modelli knock-out come presentato qui è tra le sue applicazioni più utilizzate. In questo contesto, proponiamo qui un protocollo versatile per sviluppare un knock-out della linea cellulare umana in quals...

Con il progredire del sequenziamento genico e l'identificazione di mutazioni in geni di funzioni sconosciute in un tessuto specifico, lo sviluppo di modelli cellulari rilevanti per comprendere la funzione di un nuovo gene bersaglio e confermare il suo coinvolgimento nei relativi meccanismi fisiopatologici costituisce uno strumento essenziale. Inoltre, questi modelli sono di grande importanza per i futuri sviluppi terapeutici 1,2 e costituiscono un'interessante alternativa allo sviluppo di modelli animali knock-out in linea retta con le raccomandazioni internazionali per la riduzione dell'uso di animali nella sperimentazione. L'editing genetico con CRISPR/Cas9 è tra gli strumenti più potenti attualmente disponibili, che ha permesso lo sviluppo di molti modelli knock-out/knock-in, e la validazione genica mirata con CRISPR/Cas9 è tra le applicazioni più utilizzate di CRISPR/Cas93. Il successo dell'editing genetico si basa sulla capacità di introdurre gli strumenti CRISPR (gli RNA guida e la nucleasi Cas9) nel modello cellulare target, che può essere una sfida in molte cellule difficili da trasfettare, come le cellule muscolari4. Questa sfida può essere superata con l'uso del virus, di solito lentivirus, che ha il grande vantaggio di trasdurre in modo efficiente molti tipi di cellule e fornire il suo transgene. Ma il suo principale svantaggio è l'integrazione del transgene nel genoma della cellula ospite, che porta a una potenziale alterazione dei geni localizzati nel sito di integrazione e all'espressione permanente del transgene, che nel caso della nucleasi Cas9 comporterebbe conseguenze dannose5. Merienne e colleghi6 hanno proposto una soluzione intelligente, che consiste nell'introduzione nelle cellule di un RNA guida mirato al gene Cas9 stesso, portando all'inattivazione di Cas9. Un adattamento di questa strategia è presentato qui come un protocollo facile da usare e versatile che consente di eliminare praticamente qualsiasi gene in cellule difficili da trasfettare.
L'obiettivo del protocollo qui presentato è quello di indurre l'inattivazione di un gene di interesse nelle cellule muscolari immortalizzate. Può essere usato per mettere fuori uso qualsiasi gene di interesse, in diversi tipi di cellule immortalizzate. Il protocollo qui descritto contiene passaggi per progettare gli RNA guida e la loro clonazione in plasmidi lentivirali, per produrre gli strumenti CRISPR in vettori lentivirali, per trasdurre le cellule con i diversi lentivirus e per clonare le cellule per produrre una linea cellulare omogenea modificata.
Utilizzando questo protocollo, sono state sviluppate cellule muscolari scheletriche umane immortalizzate con delezione del recettore della rianodina di tipo 1 (RyR1), un canale del calcio essenziale coinvolto nel rilascio intracellulare del calcio e nella contrazione muscolare7. Il knock-out (KO) del gene è stato confermato a livello proteico utilizzando Western blot e a livello funzionale utilizzando l'imaging del calcio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CACNA1S antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA048892</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blp I</td>
			<td>NE BioLabs</td>
			<td>R0585S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631312&#160;</td>
			<td>Transfection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy blot anti Mouse IgG</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX221667-01</td>
			<td>HRP secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy blot anti Rabbit IgG</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX221666</td>
			<td>HRP secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 direct</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F10472</td>
			<td>Calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2118</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0501</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InFusion HD Precision Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638920</td>
			<td>Ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterMix Phusion High Fidelity with GC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F532L</td>
			<td>Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Heavy Chain antibody</td>
			<td>DHSB</td>
			<td>MF20</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>REF&#160;740424</td>
			<td>Maxipreparation kit for purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740952</td>
			<td>Kit for DNA extraction from cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C737303</td>
			<td>Chemically competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #87904</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>87904</td>
			<td>Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #87919</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>87919</td>
			<td>Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #8454</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td>Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V5 Tag Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>R96025&#160;</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200317</td>
			<td>Chemically competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xma I</td>
			<td>NE BioLabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of knock-out muscle cell lines using lentivirus-mediated crispr/cas9 gene editing

Un'importante applicazione delle ripetizioni palindrome brevi intervallate regolatorie raggruppate (CRISPR)/Cas 9 è lo sviluppo di linee cellulari knock-out, in particolare per studiare la funzione di nuovi geni/proteine associati a una malattia, identificati durante la diagnosi genetica. Per lo sviluppo di tali linee cellulari, due questioni principali devono essere districate: l'inserimento degli strumenti CRISPR (il Cas9 e l'RNA guida) ad alta efficienza nelle cellule scelte e la restrizione dell'attività Cas9 alla delezione specifica del gene scelto. Il protocollo qui descritto è dedicato all'inserimento degli strumenti CRISPR in cellule difficili da trasfettare, come le cellule muscolari. Questo protocollo si basa sull'uso di lentivirus, prodotti con plasmidi pubblicamente disponibili, per i quali vengono descritte tutte le fasi di clonazione per colpire un gene di interesse. Il controllo dell'attività di Cas9 è stato effettuato utilizzando un adattamento di un sistema precedentemente descritto chiamato KamiCas9, in cui la trasduzione delle cellule con un lentivirus che codifica un RNA guida mirato al Cas9 consente la progressiva abolizione dell'espressione di Cas9. Questo protocollo è stato applicato allo sviluppo di una linea cellulare muscolare umana RYR1-knock out, che è stata ulteriormente caratterizzata a livello proteico e funzionale, per confermare il knockout di questo importante canale del calcio coinvolto nel rilascio intracellulare di calcio muscolare e nell'accoppiamento eccitazione-contrazione. La procedura qui descritta può essere facilmente applicata ad altri geni nelle cellule muscolari o in altre cellule difficili da trasfettare e produrre strumenti preziosi per studiare questi geni nelle cellule umane.

Questo protocollo è stato applicato a mioblasti immortalizzati da un soggetto sano15 (le cosiddette cellule HM, per i mioblasti umani), in cui il RyR1 è stato precedentemente caratterizzato16, al fine di eliminare il gene RYR1 che codifica per la proteina RyR1. Il design dell'RNA delle guide è stato fatto per eliminare la sequenza che comprende parte dell'esone 101 e dell'introne 101 del gene. Si prevede che la cancellazione di parte dell'esone 101 provocherà l...

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Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Il protocollo descrive come generare mioblasti knock-out utilizzando CRISPR/Cas9, partendo dalla progettazione di RNA guida alla clonazione cellulare e alla caratterizzazione dei cloni knock-out.

Sviluppo di linee cellulari muscolari knock-out utilizzando l'editing genetico CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Questo protocollo consente lo sviluppo del knock-out delle cellule muscolari in qualsiasi gene, al fine di studiare ulteriormente la funzione di questo gene nel muscolo. Il vantaggio è che è economico e più veloce dello sviluppo di animali knock-out per studiare qualsiasi gene. Questa tecnica può essere utilizzata, ad esempio, per studiare il coinvolgimento di un gene appena identificato in una miopatia.Se la tecnica qui descritta viene applicata alle cellule iPS può portare allo sviluppo di cellule knock-out per qualsiasi gene in qualsiasi tipo di cellule. Per iniziare a raggruppare brevi ripetizioni palindrome regolarmente intervallate o la delezione genica mediata da CRISPR, utilizzare prima gli strumenti del browser del genoma come ensembl. org per identificare il gene bersaglio insieme alle sequenze di DNA su entrambi i lati di esso.Per ottenere l'elenco degli esoni genici, fare prima clic sulla trascrizione della sequenza di codifica proteica e poi su Exons. Quindi, fare clic su Scarica sequenza e selezionare solo Sequenza genomica per scaricare la sequenza di consenso completo dell'intero gene. Scorri l'elenco degli esoni e degli introni del gene per selezionare quelli mirati.Per la progettazione dell'RNA guida, selezionare prima le sequenze nucleotidiche degli introni immediatamente a monte e a valle della sequenza target. Quindi vai su un sito Web come crispr.tefor. net e utilizzare le sequenze selezionate per progettare due RNA guida, ciascuno lungo 20 nucleotidi senza il Protospacer Adjacent Motif separato da poche centinaia di coppie di basi.Quindi determinare la sequenza del complemento inverso per ciascun RNA guida e ordinare i primer. Per costruire cassette di RNA guida per la clonazione di plasmidi, eseguire prima una PCR con un set di primer utilizzando la ricetta e il programma descritti nel testo, quindi separare i prodotti PCR in gel di agarosio all'1% utilizzando il tampone Tris-borato-EDTA. Quindi asportare il frammento di coppia a 300 basi e purificare utilizzando un kit.Allo stesso modo, dopo aver eseguito un'altra PCR con l'altro set di primer, purificare un frammento di DNA lungo una coppia di 400 basi in 20 microlitri di tampone di eluizione. Per inserire le cassette di RNA guida in una spina dorsale plasmidica lentivirale, impostare prima una doppia reazione di digestione del plasmide con gli enzimi di restrizione Xma 1 e Blp 1 come descritto nel testo. Dopo aver incubato il tubo di reazione a 37 gradi Celsius per un'ora, incubarlo a 65 gradi Celsius per 20 minuti, quindi eseguire il prodotto di digestione in un gel di agarosio all'1% e purificare il plasmide di circa 10 coppie di kilobasi utilizzando un kit appropriato.Quantificare anche il prodotto purificato misurando la densità ottica. Per legare la cassetta dell'RNA guida con il plasmide, preparare una miscela di reazione con l'RNA guida purificato, il DNA plasmidico linearizzato, l'enzima e l'acqua a un volume finale di 10 microlitri, quindi incubare il tubo di reazione a 50 gradi Celsius per 15 minuti per generare il plasmide finale, chiamato pGuide. Per la produzione di lentivirus, seminare prima una piastra di 145 centimetri con 1 milione di HEK 293 cellule in DMEM con glucosio alto e piruvato integrato con il 10% fbS e l'1% di penicillina o streptomicina.Quindi far crescere le cellule a 37 gradi Celsius per tre giorni in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Il quarto giorno controllare le cellule per garantire una confluenza dal 60 al 65%. Quindi preparare la soluzione di trasfezione costituita dal plasmide di interesse, dal plasmide che codifica l'involucro del virus, dal plasmide psPAX2 di imballaggio lentivirale e dal fosfato di calcio.Regolare il volume finale a 1000 microlitri con acqua. Quindi aggiungere la soluzione di trasfezione a goccia a un millilitro di 2X HBS sotto agitazione e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti. Successivamente, aggiungere la soluzione dropwise alle celle.Per una distribuzione omogenea della soluzione di trasfezione, inclinare delicatamente la piastra in tutte le direzioni, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% per almeno cinque ore. Quindi, rimuovere il supporto dalle piastre e lavare le cellule con PBS per eliminare i reagenti di trasfezione, quindi aggiungere 12 millilitri di mezzo fresco. Dopo 48 ore di incubazione a 37 gradi Celsius, raggruppare il supporto da tutte le piastre in un tubo.Mettere il tubo in un secchio sigillato e centrifugare a 800 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi filtrare il surnatante usando un filtro da 0,45 micrometri e centrifugare il filtrato a 68, 300 volte G per due ore a quattro gradi Celsius, usando un rotore a benna oscillante. Dopo aver rimosso il surnatante, tenere i tubi capovolti su un tovagliolo di carta in un armadietto di sicurezza per cinque o 10 minuti per la massima rimozione del liquido dal pellet. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di proliferazione HEC e mantenere i tubi a quattro gradi Celsius per almeno due ore.Quindi risospesare il pellet mediante pipettaggio. Dopo aver raccolto tutti i pellet risospesi, fare aliquote di 10 o 25 microlitri, quindi conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius dopo il congelamento a scatto in idrogeno liquido. Per la trasduzione dei mioblasti, seminare prima ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di terreno di proliferazione contenente 10.000 cellule di mioblasti.Il giorno successivo, aggiungere volumi precalcolati di guide BT e LV Cas9 alle celle in un armadio di sicurezza. Dopo cinque giorni di incubazione, rilasciare le cellule dal pozzo aggiungendo tripsina. Dopo aver contato i numeri di cella, trasferire le celle dai pozzetti con una confluenza dal 40 al 50% a una nuova piastra.Dopo cinque ore di incubazione, aggiungere volumi calcolati di LV killer a una molteplicità di infezione di 20 e incubare per cinque a 10 giorni o almeno due passaggi intermedi. Per la caratterizzazione funzionale dei cloni geneticamente modificati mediante imaging del calcio, piastra 50.000 cellule al centro di una parabola da 35 millimetri rivestita di laminina. Per indurre la differenziazione, aggiungere il mezzo di differenziazione come descritto nel testo.Dopo sei giorni di incubazione, togliere il terreno di coltura e delineare le cellule con una penna idrofoba. Quindi aggiungere 50 microlitri di Fluo-4 Direct, diluiti uno a uno nel mezzo di differenziazione, ai miotubi differenziati. Dopo aver incubato i piatti a 37 gradi Celsius per 30 minuti, lavare le cellule due volte con tampone Krebs integrato con un milligrammo per millilitro di glucosio.Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita o un microscopio confocale con un obiettivo 10X per misurare le variazioni di fluorescenza ad una velocità di un fotogramma al secondo per 90 secondi e scegliere un campo con almeno 10 miotubi. Dopo aver rimosso il tampone di Krebs aggiuntivo, stimolare le cellule con due millilitri di cloruro di potassio per la depolarizzazione della membrana o due millilitri di metacresolo floroclorale o stimolazione diretta 4CmC o RyR1. Visualizza la variazione di fluorescenza dopo la stimolazione, quindi quantifica la variazione di fluorescenza in ciascun miotubo.Questo protocollo potrebbe essere utilizzato con successo per eliminare il gene RyR1 dai mioblasti umani, il che ha portato a un DNA genomico più corto nelle cellule. Il knock-out di RyR1 è stato confermato anche a livello proteico poiché la proteina RyR1 non poteva essere rilevata nelle cellule bersaglio mediante Western blotting. L'assenza di attività di RyR1 nei miotubi differenziati dalle cellule knock-out RyR1 è stata ulteriormente verificata mediante imaging del calcio Fluo-4 dopo stimolazione diretta RyR1 da 4CmC o stimolazione indiretta mediante depolarizzazione della membrana indotta da cloruro di potassio.La sequenza che verrà eliminata dovrebbe essere necessaria per la previsione di una proteina funzionale. Questa tecnica è ideale per lo sviluppo di strumenti post-genomici per studiare il coinvolgimento di nuovi geni nella malattia muscolare.

Research

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Genetics

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Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...