Name: development of knock-out muscle cell lines using lentivirus-mediated crispr/cas9 gene editing
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) og fra Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Muskelbiopsier ble hentet fra Bank of Tissues for Research (Myobank, en partner i EU-nettverket EuroBioBank, Paris, Frankrike) i samsvar med europeiske anbefalinger og fransk lovgivning. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle individer. Udødelige myoblaster ble vennlig produsert av Dr. V. Mouly (Myology Institute, Paris, Frankrike), og protokollene ble godkjent av Myology Institute ethic committee (MESRI, n AC-2019-3502).
1. CRISPR guide design
<ol><li>Identifi...

<ol>
	<li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries.">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li><li>Fuster-Garc&#237;a, C., Garc&#237;a-Boh&#243;rquez, B., Rodr&#237;guez-Mu&#241;oz, A., Mill&#225;n, J. M., Garc&#237;a-Garc&#237;a, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies.">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473 (2020).</li><li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+therapeutics:+current+challenges+and+future+applications.">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing.">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li><li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system.">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li><li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes.">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li><li>Marty, I., Faur&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies.">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li><li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPOR:+intuitive+guide+selection+for+CRISPR/Cas9+genome+editing+experiments+and+screens.">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li><li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quick,+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel.">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li><li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li><li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins.">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li><li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dusty+core+disease'+(DuCD):+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies.">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).</li><li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle.">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li><li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function.">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).</li><li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+(p.Y4864H)+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein.">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li><li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+old+and+the+new:+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology.">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103 (2020).</li><li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering,+communicating,+and+engineering+the+CRISPR+PAM.">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li><li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titration+of+lentiviral+vectors.">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , (2006).</li></ol>

Et viktig skritt på vei til karakterisering av gener av ukjent funksjon involvert i patologier er utviklingen av relevante cellulære modeller for å studere funksjonen til disse genene. Bruken av genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er et eksponentielt voksende forskningsfelt, og utviklingen av knock-out modeller som presenteres her er blant de mest brukte applikasjonene. I denne sammenhengen foreslår vi her en allsidig protokoll for å utvikle en menneskelig cellelinje knock-out i ethvert gen av interesse, slik at ...

Med fremdriften av gensekvensering og identifisering av mutasjoner i gener av ukjente funksjoner i et bestemt vev, utgjør utviklingen av relevante cellulære modeller for å forstå funksjonen til et nytt målgen og bekrefte dets involvering i de relaterte patofysiologiske mekanismene et viktig verktøy. I tillegg er disse modellene av stor betydning for fremtidig terapeutisk utvikling 1,2, og utgjør et interessant alternativ til utvikling av knock-out dyremodeller i rett tråd med de internasjonale anbefalingene for reduksjon i bruk av dyr i eksperimentering. Genredigering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de kraftigste verktøyene som for tiden er tilgjengelige, noe som har gjort det mulig å utvikle mange knock-out/knock-in-modeller, og målrettet genvalidering ved hjelp av CRISPR/Cas9 er blant de mest brukte bruksområdene til CRISPR/Cas93. Suksessen med genredigering er avhengig av muligheten til å introdusere CRISPR-verktøyene (guiden RNAer og kjernen Cas9) i målcellemodellen, noe som kan være en utfordring i mange vanskelig å transfektceller, for eksempel muskelceller4. Denne utfordringen kan overvinnes ved bruk av virus, vanligvis lentivirus, som har den store fordelen å transdusere effektivt mange celletyper og levere transgene. Men den største ulempen er integrasjonen av transgene i vertscellegenomet, noe som fører til potensiell endring av gener lokalisert på integrasjonsstedet og til det permanente uttrykket av transgene, som i tilfelle av kjernen Cas9 ville føre til skadelige konsekvenser5. En smart løsning er foreslått av Merienne og kolleger6, som består av introduksjon i cellene i en guide-RNA rettet mot Selve Cas9-genet, noe som fører til Cas9-inaktivering. En tilpasning av denne strategien presenteres her som en brukervennlig og allsidig protokoll som gjør det mulig å slå ut praktisk talt ethvert gen i celler som er vanskelige å transfekter.
Målet med protokollen som presenteres her er å indusere inaktivering av et gen av interesse for udødelige muskelceller. Det kan brukes til å slå ut ethvert gen av interesse, i forskjellige typer udødelige celler. Protokollen som er beskrevet her inneholder trinn for å designe guiden RNAer og deres kloning i lentivirale plasmider, for å produsere CRISPR-verktøyene i lentivirale vektorer, for å transdusere cellene med de forskjellige lentivirusene, og å klone cellene for å produsere en homogen redigert cellelinje.
Ved hjelp av denne protokollen er udødeliggjorte humane skjelettmuskulaturceller utviklet med sletting av type 1 ryanodinreseptoren (RyR1), en viktig kalsiumkanal involvert i intracellulær kalsiumfrigjøring og muskelkontraksjon7. Utslag (KO) av genet er bekreftet på proteinnivå ved hjelp av vestlig blot, og på funksjonelt nivå ved hjelp av kalsiumavbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CACNA1S antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA048892</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blp I</td>
			<td>NE BioLabs</td>
			<td>R0585S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>631312&#160;</td>
			<td>Transfection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy blot anti Mouse IgG</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX221667-01</td>
			<td>HRP secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy blot anti Rabbit IgG</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX221666</td>
			<td>HRP secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 direct</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F10472</td>
			<td>Calcium imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH(14C10) Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#2118</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0501</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InFusion HD Precision Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638920</td>
			<td>Ligation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterMix Phusion High Fidelity with GC</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F532L</td>
			<td>Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin Heavy Chain antibody</td>
			<td>DHSB</td>
			<td>MF20</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>REF&#160;740424</td>
			<td>Maxipreparation kit for purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Tissue</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740952</td>
			<td>Kit for DNA extraction from cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot Stbl3 Chemically Competent&#160;E. coli</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C737303</td>
			<td>Chemically competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #87904</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>87904</td>
			<td>Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #87919</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>87919</td>
			<td>Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #12260</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td>Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid #8454</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>8454</td>
			<td>Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V5 Tag Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogene</td>
			<td>R96025&#160;</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200317</td>
			<td>Chemically competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xma I</td>
			<td>NE BioLabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of knock-out muscle cell lines using lentivirus-mediated crispr/cas9 gene editing

En viktig anvendelse av grupperte regulatoriske interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas 9 er utviklingen av knock-out cellelinjer, spesielt for å studere funksjonen til nye gener / proteiner forbundet med en sykdom, identifisert under den genetiske diagnosen. For utvikling av slike cellelinjer må to store problemer løsnes: innsetting av CRISPR-verktøyene (Cas9 og guiden RNA) med høy effektivitet i de valgte cellene, og begrensning av Cas9-aktiviteten til den spesifikke slettingen av det valgte genet. Protokollen som er beskrevet her, er dedikert til innsetting av CRISPR-verktøyene i vanskelige å transfektceller, for eksempel muskelceller. Denne protokollen er basert på bruk av lentivirus, produsert med plasmider offentlig tilgjengelig, som alle kloningstrinnene er beskrevet for å målrette mot et gen av interesse. Kontrollen av Cas9-aktivitet har blitt utført ved hjelp av en tilpasning av et tidligere beskrevet system kalt KamiCas9, der transduksjonen av cellene med et lentivirus som koder en guide RNA rettet mot Cas9 tillater progressiv avskaffelse av Cas9-uttrykk. Denne protokollen har blitt brukt på utviklingen av en RYR1-knock out menneskelig muskelcellelinje, som har blitt ytterligere karakterisert på protein- og funksjonsnivå, for å bekrefte utslag av denne viktige kalsiumkanalen involvert i muskelintracellulær kalsiumfrigjøring og i eksitasjons-sammentrekningskobling. Prosedyren beskrevet her kan lett brukes på andre gener i muskelceller eller i andre vanskelige å transfektceller og produsere verdifulle verktøy for å studere disse genene i menneskelige celler.

Denne protokollen ble brukt på udødeliggjorte myoblaster fra et sunt emne15 (såkalte HM-celler, for menneskelige myoblaster), der RyR1 tidligere har blitt karakterisert16, for å slå ut RYR1-genet som koder RyR1-proteinet. Utformingen av guidene RNA ble laget for å slette sekvensen som omfatter en del av exon 101 og intron 101 av genet. Sletting av deler av exon 101 forutsettes å føre til forstyrrelser i leserammen. I tillegg koder exon 101 poren av proteine...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing at JoVE.com

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Protokollen beskriver hvordan du genererer knock-out myoblasts ved hjelp av CRISPR / Cas9, fra utformingen av guide-RNAer til cellulær kloning og karakterisering av knock-out klonene.

Utvikling av knock-out muskelcellelinjer ved hjelp av lentivirusmediert CRISPR / Cas9 genredigering

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Denne protokollen tillater utvikling av muskelcelle knock-out i ethvert gen, for å videre studere funksjonen til dette genet i muskel. Fordelen er at det er billig og raskere enn utviklingen av knock-out dyr for å studere noe gen. Denne teknikken kan for eksempel brukes til å studere involvering av et nylig identifisert gen i en myopati.Hvis teknikken beskrevet her brukes på iPS-celler, kan det føre til utvikling av utslagsceller for ethvert gen i alle typer celler. For å begynne å gruppere regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner eller CRISPR-mediert gensletting, bruk først genomleserverktøy som ensembl. for å identifisere målgenet sammen med DNA-sekvensene på begge sider av det.For å få listen over gen exons, klikk først på transkripsjonen av proteinkodingssekvensen og deretter på Exons. Deretter klikker du på Last ned sekvens og velger bare genomisk sekvens for å laste ned hele konsensussekvensen til hele genet. Bla gjennom listen over eksoner og introner av genet for å velge de målrettede.For utforming av guide RNA, velg først nukleotidsekvenser av intronene umiddelbart oppstrøms og nedstrøms for målsekvensen. Gå deretter til et nettsted som crispr.tefor. net og bruke de valgte sekvensene til å designe to guide RNAer, hver 20 nukleotider lang uten Protospacer Tilstøtende Motiv atskilt med noen hundre basepar.Deretter bestemmer du den omvendte komplementsekvensen for hver guide RNA og bestiller primerne. For å konstruere guide RNA kassetter for plasmid kloning, kjør først en PCR med ett sett med primere ved hjelp av oppskriften og programmet som er beskrevet i teksten, og skill deretter PCR-produktene i 1% agarose gel ved hjelp av Tris-borate-EDTA buffer. Deretter eksiserer du 300-baseparfragmentet og renser ved hjelp av et sett.På samme måte, etter å ha kjørt en annen PCR med det andre primersettet, renser du et 400-base par langt DNA-fragment i 20 mikroliter elutionbuffer. For å sette guiden RNA-kassetter inn i en lentiviral plasmid ryggrad, må du først sette opp en dobbel fordøyelsesreaksjon av plasmidet med begrensningsenzymene Xma 1 og Blp 1 som beskrevet i teksten. Etter å ha inkubert reaksjonsrøret ved 37 grader Celsius i en time, inkuber det ved 65 grader Celsius i 20 minutter, kjør deretter fordøyelsesproduktet i en 1% agarose gel og rens plasmidet på ca 10 kilobasepar ved hjelp av et passende sett.Kvantifisere også det rensede produktet ved å måle den optiske tettheten. For å ligate guiden RNA-kassetten med plasmiden, lag en reaksjonsblanding med den rensede guiden RNA, det lineariserte plasmid-DNA- og vannet til et sluttvolum på 10 mikroliter, og inkuber deretter reaksjonsrøret ved 50 grader Celsius i 15 minutter for å generere den endelige plasmiden, kalt pGuide. For lentivirusproduksjon, første frø en 145-centimeter plate med 1 million HEK 293 celler i DMEM med høy glukose og pyruvat supplert med 10% FBS og 1% penicillin eller streptomycin.Deretter vokser cellene ved 37 grader Celsius i tre dager i en 5% karbondioksidinkubator. På den fjerde dagen sjekk cellene for å sikre 60 til 65% samløp. Deretter forbereder du transfeksjonsløsningen som består av plasmid av interesse, plasmidkoding av viruskonvolutten, lentiviral emballasje plasmid psPAX2 og kalsiumfosfat.Juster det endelige volumet til 1000 mikroliter med vann. Tilsett deretter transfeksjonsløsningen dråpevis til en milliliter 2X HBS under agitasjon og inkuber ved romtemperatur i minst 10 minutter. Deretter legger du løsningen dråpevis til cellene.For en homogen fordeling av transfeksjonsløsningen, vipp platen forsiktig i alle retninger, og inkuber deretter cellene ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidinkubator i minst fem timer. Deretter fjerner du mediet fra platene og vasker cellene med PBS for å kvitte seg med transfeksjonsreagensene, og tilsett deretter 12 milliliter friskt medium. Etter 48 timers inkubasjon ved 37 grader Celsius, samle media fra alle platene i et rør.Legg røret i en forseglet bøtte og sentrifuge ved 800 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius, filtrer deretter supernatanten ved hjelp av et 0,45-mikrometerfilter og sentrifuger filtratet ved 68 300 ganger G i to timer ved fire grader Celsius, ved hjelp av en svingende bøtterotor. Etter å ha fjernet supernatanten, hold rørene opp ned på et papirhåndkle i et sikkerhetsskap i fem til 10 minutter for maksimal fjerning av væske fra pelletsene. Tilsett 100 mikroliter HEC-spredningsmedium og hold rørene på fire grader Celsius i minst to timer.Deretter resuspenderer pellet ved pipettering. Etter å ha samlet alle de resuspenderte pelletsene, lag aliquots på 10 eller 25 mikroliter, og lagre deretter aliquots på minus 80 grader Celsius etter snapfrysing i flytende hydrogen. For myoblasttransduksjon, første frø hver brønn av en 96-brønns plate med 100 mikroliter spredningsmedium som inneholder 10.000 myoblastceller.Neste dag legger du til forhåndsberegnede volumer av LV-guider og LV Cas9 til cellene i et sikkerhetsskap. Etter fem dager med inkubasjon, slipp cellene fra brønnen ved å legge til trypsin. Etter å ha talt cellenumrene, overfør cellene fra brønner med 40 til 50% samløp til en ny plate.Etter fem timer med inkubasjon, legg til beregnede volumer av LV-morder ved et mangfold av infeksjon på 20 og inkuber i fem til 10 dager eller minst to passasjer i mellom. For funksjonell karakterisering av de genredigerte klonene ved kalsiumavbildning, plate 50 000 celler i midten av en lamininbelagt 35 millimeter tallerken. Hvis du vil lage differensiering, legger du til differensieringsmediet som beskrevet i teksten.Etter seks dager med inkubasjon, ta av kulturmediet og avgrens cellene med en hydrofob penn. Tilsett deretter 50 mikroliter Fluo-4 Direct, fortynnet en-til-en i differensieringsmedium, til de differensierte myotubene. Etter å ha inkubert oppvasken ved 37 grader Celsius i 30 minutter, vask cellene to ganger med Krebs buffer supplert med ett milligram per milliliter glukose.Bruk deretter et invertert fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop med et 10X mål om å måle fluorescensvariasjonene med en hastighet på ett bilde per sekund i 90 sekunder og velg et felt med minst 10 myotuber. Etter å ha fjernet den ekstra Krebs-bufferen, stimulere cellene med to milliliter kaliumklorid for membrandepolarisering eller to milliliter florokloral metakresol eller 4CmC eller RyR1 direkte stimulering. Visualiser fluorescensvariasjonen etter stimulering, og kvantifiser deretter fluorescensvariasjonen i hver myotube.Denne protokollen kan med hell brukes til å slå ut genet RyR1 fra menneskelige myoblaster, noe som resulterte i kortere genomisk DNA i cellene. RyR1 knock-out ble også bekreftet på proteinnivå da RyR1-proteinet ikke kunne påvises i de målrettede cellene av vestlig blotting. Fraværet av RyR1 aktivitet i myotuber differensiert fra RyR1 knock-out celler ble ytterligere verifisert av Fluo-4 kalsiumavbildning etter direkte RyR1 stimulering av 4CmC eller indirekte stimulering ved kaliumkloridindusert membran depolarisering.Sekvensen som vil bli slettet, bør være nødvendig for å forutsi et funksjonelt protein. Denne teknikken er ideell for utvikling av postgenomiske verktøy for å studere involvering av nytt gen i muskelsykdom.

Research

JoVE Journal

Genetics

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering for å identifisere et stoffresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Utvalgsavhengig og uavhengig generasjon av CRISPR / Cas9-medierte Gene Knockouts i mammale celler

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En Standard metode for å undersøke stedet genetisk virkning som en funksjon av punkt mutasjon reparasjon katalysert av CRISPR/Cas9 og SsODN i menneskeceller

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene redigering gjør betinget mutanter av menneskelig malariaparasitten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediert presis Genredigering av tube electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

Direkte Gene knock-out av Axolotl spinal Cord nevrale stamceller via electroporation av CAS9 protein-gRNA komplekser

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...