Denne metode adresserer udfordringerne ved dybfluorescensobservation i risskud, såsom en begrænset vævsindtrængning af clearingopløsningen og den reelle opløsning under konfokalmikroskop. Den største fordel ved denne teknik er en strukturobservation af meget stort væv fra et makroperspektiv, selv prompter med hårdt og tykt væv, såsom voksne skud. Denne metode gælder for dyb billeddannelse af hårdt og tykt væv i brede plantearter.
Det kan hjælpe med at fremskynde opdagelsen af nye fænomener inden for plantebiologisk forskning. Til at begynde med skal du skære rødderne forsigtigt uden at beskadige planterne og vaske dem med vand for at fjerne snavs. Brug nu pincet til at skrælle de gamle ydre blade af.
For at undgå at knuse cellerne skal du bruge en enkeltkantet barbermaskine med en glidende bevægelse til at skære vævet fra skuddet, apikalt meristem eller ung panik til bunden. Hvis placeringen af skuddet apikalt meristem eller ung panik ikke er synlig, skal du skære det længere. Risskuddet har et ovalt tværsnit.
Brug en tveægget barbermaskine til at barbere den ene side af ovalen tyndt i retning af dens lange akse. Bekræft placeringen af skuddet apikalt meristem eller ung panik ved udseendet af en hvid-ish farve i prøven og trim det overskydende væv af. Prøven anbringes i et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende en milliliter fikseringsopløsning.
Skær et stykke paraffinfilm på 2,5 kvadratcentimeter og form det til en kugle. Placer nu disse kugler oven på prøverne for at forhindre dem i at flyde ud af fikseringsopløsningen. Røret indeholdende prøven anbringes i en ekssikkator.
Luk låget på ekssikkatoren, og start vakuumpumpen for langsomt at trykke på indersiden af ekssikkatoren, indtil minus 0,095 megapascaltryk er nået. Når du har lukket ekssikkatoren ved minus 0,095 megapascal, skal du slukke for vakuumpumpen og lade den stå i 30 minutter ved stuetemperatur. Åbn ekssikkatoren lidt og vend den langsomt tilbage til atmosfærisk tryk.
Hvis prøven er korrekt fastgjort, synker den ned i fikseringsopløsningen. Og hvis det ikke synker, skal du reducere trykket igen. Fjern paraffinfilmen.
Luk låget, og hold rørene natten over ved fire grader Celsius. Brug fnugfrie servietter til at fjerne den overskydende fikseringsopløsning fra prøven og fastgør prøven på en vibrerende mikroskærebakke med øjeblikkelig lim. Prøven anbringes på en bakke med fladsiden nedad, som blev barberet af under prøveudtagningen, og beskæringsbetingelserne indstilles i henhold til den faste prøve.
Juster prøvepositionen med retur- eller fremadknappen og op- eller ned-knappen, og fyld bakken med deioniseret vand, indtil alle prøverne er nedsænket. Når du har fyldt bakken, skal du trykke på startknappen og placere de trimmede prøver på et glasglas med en dråbe PBS. Kontroller prøven, der indeholder målstedet under et stereomikroskop, og overfør den trimmede prøve til en multibrøndplade med en milliliter PBS.
Fjern PBS'en fra multibrøndpladen. Tilsæt frisk PBS og lad det stå i et minut. Fjern PBS og tilføj CS. Anbring multibrøndpladen, der indeholder prøven, i en ekssikkator, og luk låget.
Start derefter vakuumpumpen for at trykke på indersiden af ekssikkatoren indtil minus 0,09 megapascal, langsomt. Når du har lukket ekssikkatoren ved minus 0,09 megapascal, skal du slukke for vakuumpumpen og lade den stå i en time ved stuetemperatur. Åbn ekssikkatoren lidt og vend den langsomt tilbage til atmosfærisk tryk.
Hæld deioniseret vand i mellemrummet mellem brøndene for at forhindre fordampning af CS og opbevar multibrøndpladerne ved stuetemperatur i mørke til rydning. Når CS bliver grøn, skal du erstatte den med en frisk opløsning. De ikke-trimmede prøver forblev grønne og blev ikke gennemsigtige efter tre måneders behandling med de CS.In prøver, der blev skrællet af alle blade, blev interknudepunkterne hvide efter en uge, selvom knuderne forblev grønne.
Prøven blev ikke gennemsigtig efter fire uger. De håndtrimmede prøver blev hvide efter en uges CS-behandling, men blev ikke gennemsigtige efter fire uger. Prøverne trimmet til 130 mikrometer tykkelse blev gennemskinnelige efter en uges CS-behandling.
Prøven var næsten gennemsigtig efter to uger. I knuden var den observerbare dybde efter en uge af CS-behandlingen minus 60 mikrometer og minus 90 mikrometer efter to uger. Fluorescerende signaler blev observeret i en dybde på minus 80 mikrometer efter tre uger og i en dybde på minus 100 mikrometer efter fire uger.
I internoden blev fluorescerende signaler observeret i en dybde på minus 60 mikrometer uden CS-behandlingen. Den observerbare dybde var minus 90 mikrometer efter en uge til tre uger af CS-behandlingen og minus 100 mikrometer efter fire uger. I bladene blev fluorescerende signaler observeret i en dybde på minus 90 mikrometer uden CS-behandling, men lysstyrken var svagere end andre væv.
Efter en uge var signalerne lysere og observeret i en dybde på minus 120 mikrometer. Ekspressionen af transkriptionsfaktoren OS MASU 15 mOrange blev observeret i ung Panicle, blad, knude, internode og fleurette. Nøglen er at finde de bedste betingelser for planterne eller vævene, for eksempel menstruations- og vakuumtryk eller position og CS-behandling, timing, tykkelse, hastighed og passende farvningsopløsning.
Kombinationen af timing og hærdningsteknologi muliggør rumlig tidsmæssig observation af genekspressionsmønster og intercellulær kommunikation i flere væv i et enkelt afsnit.