Deze methode pakt de uitdagingen aan in Deep Fluorescence Observation in Rice Shoots, zoals een beperkte weefselpenetratie van de clearingoplossing en de echte resolutie onder confocale microscoop. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een structuurobservatie van veel grote weefsels vanuit een macroperspectief, zelfs prompts met harde en dikke weefsels, zoals volwassen scheuten. Deze methode is van toepassing op diepe beeldvorming van harde en dikke weefsels bij brede plantensoorten.
Het kan helpen de ontdekking van nieuwe fenomenen in plantenbiologisch onderzoek te versnellen. Om te beginnen, snijd de wortels voorzichtig zonder de planten te beschadigen en was ze met water om het vuil te verwijderen. Gebruik nu een pincet om de oude buitenste bladeren af te pellen.
Om te voorkomen dat de cellen worden verpletterd, gebruikt u een scheermes met één rand met een glijdende beweging om het weefsel van de scheut, apicale meristeem of jonge pluim naar de basis te snijden. Als de positie van de scheut apicale meristeem of jonge pluim niet zichtbaar is, knip deze dan langer. De rijstscheut heeft een ovale doorsnede.
Gebruik een scheermes met twee randen om een kant van het ovaal dun af te scheren, in de richting van de lange as. Bevestig de positie van de scheut apicale meristeem of jonge pluim door het verschijnen van een witachtige kleur in het monster en knip het overtollige weefsel af. Doe het monster in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met één milliliter fixatieve oplossing.
Snijd een stuk paraffinefilm van 2,5 vierkante centimeter en vorm het tot een bal. Plaats deze ballen nu bovenop de monsters om te voorkomen dat ze uit de fixatieve oplossing drijven. Plaats de buis met het monster in een exsiccator.
Sluit het deksel van de exsiccator en start de vacuümpomp om de binnenkant van de exsiccator langzaam onder druk te zetten totdat min 0,095 megapascals druk is bereikt. Nadat u de exsiccator op min 0,095 megapascal hebt gesloten, schakelt u de vacuümpomp uit en laat u deze 30 minuten op kamertemperatuur staan. Open de exsiccator iets en breng deze langzaam terug naar atmosferische druk.
Als het monster correct is gefixeerd, zinkt het in de fixatieve oplossing. En als het niet zinkt, verlaag dan de druk opnieuw. Verwijder de paraffinefilm.
Sluit het deksel en houd de buizen een nacht op vier graden Celsius. Verwijder met pluisvrije doekjes de overtollige fixatieve oplossing uit het monster en bevestig het monster op een trillende microsnijmachinelade met instant lijm. Plaats het monster op een bakje met de platte kant naar beneden dat tijdens de bemonstering is afgeschoren en stel de trimomstandigheden in op basis van het vaste monster.
Pas de monsterpositie aan met de knop achteruit of vooruit en de knop Omhoog of Omlaag en vul de lade met gedeïoniseerd water totdat alle monsters zijn ondergedompeld. Nadat u de lade hebt gevuld, drukt u op de startknop en plaatst u de bijgesneden monsters op een glazen schuif met een druppel PBS. Controleer het monster met de doellocatie onder een stereomicroscoop en breng het bijgesneden monster over naar een multi-well plaat met één milliliter PBS.
Verwijder de PBS van de multi-well plaat. Voeg verse PBS toe en laat het een minuut staan. Verwijder PBS en voeg de CS toe. Plaats de multi-well plaat met het monster in een exsiccator en sluit het deksel.
Start vervolgens de vacuümpomp om de binnenkant van de exsiccator langzaam onder druk te zetten tot min 0,09 megapascal. Nadat u de exsiccator op min 0,09 megapascal hebt gesloten, schakelt u de vacuümpomp uit en laat u deze een uur op kamertemperatuur staan. Open de exsiccator iets en breng deze langzaam terug naar atmosferische druk.
Giet gedeïoniseerd water in de opening tussen de putten om de verdamping van de CS te voorkomen en bewaar de multi-well platen bij kamertemperatuur in het donker voor opruiming. Wanneer de CS groen wordt, vervangt u deze door een nieuwe oplossing. De niet-bijgesneden monsters bleven groen en werden niet transparant na drie maanden behandeling met de CS.In monsters die van alle bladeren werden afgepeld, werden de interknopen na een week wit, hoewel de knopen groen bleven.
Het monster werd na vier weken niet transparant. De met de hand getrimde monsters werden wit na een week CS-behandeling, maar werden na vier weken niet transparant. De monsters die tot 130 micrometer dikte werden bijgesneden, werden doorschijnend na een week CS-behandeling.
Het monster was na twee weken bijna transparant. In het knooppunt was de waarneembare diepte na één week van de CS-behandeling min 60 micrometer en min 90 micrometer na twee weken. Fluorescerende signalen werden waargenomen op een diepte van min 80 micrometer na drie weken en op een diepte van min 100 micrometer na vier weken.
In de internode werden fluorescerende signalen waargenomen op een diepte van min 60 micrometer zonder de CS-behandeling. De waarneembare diepte was min 90 micrometer na één week tot drie weken cs-behandeling en min 100 micrometer na vier weken. In de bladeren werden fluorescerende signalen waargenomen op een diepte van min 90 micrometer zonder CS-behandeling, maar de helderheid was zwakker dan andere weefsels.
Na een week waren de signalen helderder en waargenomen op een diepte van min 120 micrometer. De expressie van de transcriptiefactor OS MASU 15 mOrange werd waargenomen bij jonge Panicle, leaf, node, internode en fleurette. De sleutel is om de beste omstandigheden voor de planten of weefsels te vinden, bijvoorbeeld periode- en vacuümdruk, of positie, en CS-behandeling, timing, dikte, snelheid en geschikte kleuringsoplossing.
De combinatie van timing- en genezingstechnologie maakt ruimtelijke temporele observatie van genexpressiepatroon en intercellulaire communicatie in meerdere weefsels van een enkele sectie mogelijk.